PROTEIN ENGINEERING, odvetvie molekulárnej biológie a bioinžinierstva, medzi ktorého úlohy patrí cieľavedomá zmena štruktúry prírodných bielkovín a produkcia nových bielkovín s požadovanými vlastnosťami. Proteínové inžinierstvo vzniklo na začiatku osemdesiatych rokov, keď boli vyvinuté metódy genetického inžinierstva, ktoré umožnili získať rôzne prírodné proteíny pomocou baktérií alebo kvasiniek, ako aj určitým spôsobom zmeniť štruktúru génov a podľa toho aj sekvenciu aminokyselín ( primárna štruktúra) proteínov, ktoré kódujú. Na základe princípov organizácie proteínových molekúl, vzťahu medzi štruktúrou a funkciou proteínov vytvára proteínové inžinierstvo vedecky podloženú technológiu pre riadené zmeny ich štruktúry. Pomocou proteínového inžinierstva je možné zvýšiť tepelnú stabilitu proteínov, ich odolnosť voči denaturačným účinkom, organickým rozpúšťadlám a zmeniť ich ligand-väzobné vlastnosti. Proteínové inžinierstvo umožňuje nahradením aminokyselín zlepšiť fungovanie enzýmov a ich špecifickosť, zmeniť optimálne hodnoty pH, pri ktorých enzým funguje, eliminovať nežiaduce vedľajšie aktivity, eliminovať molekulárne oblasti, ktoré inhibujú enzymatické reakcie, zvýšiť účinnosť proteínových bielkovín. lieky a tak ďalej. Napríklad nahradenie len jedného treonínového zvyšku alanínovým alebo prolínovým zvyškom umožnilo 50-násobné zvýšenie aktivity enzýmu tyrozyl tRNA syntetázy a v dôsledku nahradenia 8 aminokyselinových zvyškov tzv. proteáza z Bacillus stearothermophilus získala schopnosť udržať aktivitu pri 120 ° C počas niekoľkých hodín. Proteínové inžinierstvo zahŕňa aj práce na riadenej zmene vlastností proteínov pomocou chemických modifikácií, napríklad zavedenie fotoaktivovaných zlúčenín, ktoré menia vlastnosti molekuly pôsobením svetla, označovanie zlúčenín, ktoré umožňujú sledovanie dráh proteínu v bunka alebo jej nasmerovanie na rôzne zložky bunky a pod. Takáto práca sa vykonáva hlavne na rekombinantných proteínoch získaných pomocou metód genetického inžinierstva.
V proteínovom inžinierstve možno rozlíšiť dva smery: racionálny dizajn a riadený molekulárny vývoj proteínov. Prvý zahŕňa využitie informácií o štruktúrno-funkčných vzťahoch v proteínoch, získaných pomocou fyzikálno-chemických a biologických metód, ako aj počítačového molekulárneho modelovania, s cieľom určiť, ktoré zmeny v primárnej štruktúre by mali viesť k požadovanému výsledku. Aby sa zvýšila tepelná stabilita proteínu, je potrebné určiť jeho priestorovú štruktúru, identifikovať „slabé“ oblasti (napríklad aminokyseliny, ktoré nie sú silne spojené s ich prostredím) a vybrať najlepšie možnosti substitúcie za iné aminokyseliny pomocou molekulárneho modelovania a optimalizácie energetických parametrov molekuly; potom zmutujte zodpovedajúci gén a potom získajte a analyzujte mutantný proteín. Ak tento proteín nespĺňa špecifikované parametre, vykonajte novú analýzu a zopakujte popísaný cyklus. Tento prístup sa najčastejšie používa v prípade konštrukcie umelých proteínov (proteíny de novo) s požadovanými vlastnosťami, keď vstup obsahuje novú aminokyselinovú sekvenciu, prevažne alebo úplne špecifikovanú osobou, a výstup je molekula proteínu s požadovanými vlastnosťami. Zatiaľ sa však takto dajú získať len malé de novo proteíny s jednoduchou priestorovou štruktúrou a dajú sa do nich zaviesť jednoduché funkčné aktivity, napríklad miesta viažuce kov alebo krátke peptidové fragmenty, ktoré nesú akékoľvek biologické funkcie.
Pri riadenej molekulárnej evolúcii proteínov sa metódami genetického inžinierstva získa veľký súbor rôznych mutantných génov cieľového proteínu, ktoré sa potom špeciálnym spôsobom exprimujú, najmä na povrchu fágov („fágový displej“) alebo v bakteriálnych buniek, aby bolo možné vybrať mutanty s najlepšími vlastnosťami. Na tento účel napríklad gény ten správny proteín alebo jeho časti sú integrované do genómu fága - do zloženia génu kódujúceho proteín umiestnený na povrchu častice fágu. Každý jednotlivý fág zároveň nesie svoj vlastný mutantný proteín, ktorý má určité vlastnosti, podľa ktorých sa robí selekcia. Mutantné gény sa vyrábajú "zmiešaním" súboru génov z podobných prírodných proteínov z rôznych organizmov, zvyčajne pomocou metódy polymerázovej reťazovej reakcie, takže každý výsledný mutantný proteín môže obsahovať fragmenty mnohých "rodičovských" proteínov. Tento prístup v podstate napodobňuje prirodzenú evolúciu bielkovín, no len oveľa rýchlejším tempom. Hlavnou úlohou proteínového inžiniera je v tomto prípade vyvinúť efektívny selekčný systém, ktorý umožní výber najlepších mutantných proteínových variantov s požadovanými parametrami. V prípade vyššie uvedenej úlohy - zvýšiť tepelnú stabilitu proteínu - je možné selekciu uskutočniť napríklad pestovaním buniek obsahujúcich mutantné gény pri zvýšenej teplote (za predpokladu, že prítomnosť mutantného proteínu v bunke zvyšuje jej tepelná stabilita).
Obe tieto oblasti proteínového inžinierstva majú rovnaký cieľ a navzájom sa dopĺňajú. Štúdium mutantných proteínových variantov získaných metódami molekulárnej evolúcie teda umožňuje lepšie pochopiť štruktúrnu a funkčnú organizáciu proteínových molekúl a využiť získané poznatky pre cieľavedomý racionálny návrh nových proteínov. Ďalší rozvoj proteínového inžinierstva umožňuje riešiť mnohé praktické problémy zlepšovania prírodných a získavania nových bielkovín pre potreby medicíny, poľnohospodárstva a biotechnológie. V budúcnosti je možné vytvárať proteíny s funkciami v prírode neznámymi.
Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Proteínové inžinierstvo 20 rokov // Recenzie prírody. Molekulárna bunková biológia. 2002 Vol. 3. č. 12; Patrushev L. I. Umelé genetické systémy. M., 2004. Zväzok 1: Genetické a proteínové inžinierstvo.
480 rubľov. | 150 UAH | 7,5 $, MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Diplomová práca - 480 rubľov, doprava 10 minút 24 hodín denne, sedem dní v týždni a sviatky
Jefimov Grigorij Alexandrovič. Nové geneticky upravené proteíny založené na rekombinantných protilátkach proti TNF: dizertačná práca... Kandidát biologických vied: 03.01.03 / Efimov Grigory Alexandrovich; [Miesto ochrany: Ústav molekulárnej biológie pomenovaný po V.A. - 122 s.
Úvod
Prehľad literatúry 9
1. História otvorenia tnf 9
2. Nadrodina tnf 10
3. Štruktúra systému tnfnfr 12
4. funkcie tnf 15
5. Úloha TNF v patogenéze reumatoidnej artritídy a iných autoimunitných ochorení 16
6. Terapeutická blokáda tnf 18
7. Vedľajšie účinky a obmedzenia anti-inf terapie 23
8. Nové prístupy a perspektívy blokovania tnf 25
Materiály a metódy výskumu 29
1. Príprava a charakterizácia novej ťavej jednodoménové anti-ľudskej tnf protilátky 29
Expresia a purifikácia jednodoménovej protilátky Vhh41 29
Hodnotenie väzby protilátky Vhh41 na ľudský TNF pomocou ELISA 30
Štúdium interakcie Vhh41 a ľudského TNF pomocou povrchovej plazmatickej rezonancie 31
Štúdie o schopnosti Vhh41 blokovať ľudský TNF 31
2. Konštrukcia, výroba a charakterizácia hybridných proteínov TNF fluorescenčných senzorov 32
Konštrukcia génov kódujúcich TNF senzory. 32
Expresia a purifikácia fluorescenčných TNF senzorov. 33
Analýza interakcie Vhh41-K s rekombinantným TNF. 34
Skúmanie biologických vlastností fluorescenčného senzora Vhh41-KTNF in vitro a in vivo. Z5
Štúdia schopnosti fluorescenčného senzora viazať TNF in vivo 36
In vivo štúdia expresie TNF pomocou výsledného fluorescenčného senzora...39
3. Produkcia a charakterizácia jednoreťazcovej ANTINF protilátky 40
Štúdia myšacej monoklonálnej protilátky F10 40
Konštrukcia a expresia jednoreťazcovej protilátky ahT-4 41
Meranie biologickej aktivity jednoreťazcovej protilátky ahT-4 42
4. Príprava a charakterizácia chimérickej anti-inf protilátky 43
5. Konštrukcia, príprava a charakterizácia bišpecifických protilátok A9 a MA9 43
Konštrukcia, expresia a purifikácia protilátok A9 a tA9 43 Interakcia protilátok A9 a tA9 s metódou rekombinantného ľudského TNF
povrchová plazmová rezonancia 44
Cytotoxický test 45
Cytofluorimetria 45
Hodnotenie schopnosti bišpecifickej protilátky A9 zadržiavať ľudský TNF
povrch makrofágov 45
6. Porovnávacie hodnotenie účinnosti systémového a selektívneho blokovania makrofágového TNF 46
Model akútnej hepatotoxicity vyvolanej podaním JIIJC/D-galaktozamínu 46
Výsledky a diskusia 48
1. Získanie a charakterizácia novej rekombinantnej protilátky s jednou doménou, ktorá sa špecificky viaže na ľudský TNF, ale neblokuje jeho biologickú aktivitu 50
Vytvorenie genetického konštruktu kódujúceho rekombinantnú protilátku s jednou doménou
Expresia a purifikácia rekombinantnej jednodoménové protilátky Vhh41 52
Analýza interakcie jednodoménovej protilátky Vhh41 s ľudským TNF 53
Analýza schopnosti protilátky Vhh41 blokovať biologickú aktivitu ľudského TNF.54
2. Konštrukcia, výroba a charakterizácia molekulárnych senzorov TNF pre in vivo štúdium expresie tnf na báze jednodoménových rekombinantných protilátok a červeného fluorescenčného proteínu 56
Získanie genetických konštruktov kódujúcich fluorescenčný senzor TNF Vhh41-Ku
kontrolné fúzne proteíny 56
Expresia a purifikácia TNF Vhh41-K fluorescenčného senzora. 57
Analýza interakcie fluorescenčného senzora TNF Vhh41-K s rekombinantným myšacím TNF
a človek 58
Štúdium biologických vlastností fluorescenčného senzora TNF Vhh41-Kin vitro a in vivo. 61
Štúdium schopnosti fluorescenčného senzora viazať TNF in vivo 66
In vivo štúdia expresie TNF pomocou získaného fluorescenčného senzora... 69
3. Príprava a charakterizácia rekombinantnej jednoreťazcovej protilátky blokujúcej biologickú aktivitu TNF 72
Meranie aktivity myšej monoklonálnej protilátky F10 72
Konštrukcia jednoreťazcovej protilátky na základe variabilných fragmentov pľúc a
ťažké reťazce myšacej monoklonálnej protilátky F 10 74
Meranie aktivity jednoreťazcovej protilátky ahT-4 75
4. Vývoj a analýza chimérickej protilátky proti ľudskému TNF
Porovnanie kinetiky interakcií chimérickej protilátky 13239 a infliximabu s
rekombinantný ľudský TNF 77 Porovnanie neutralizačnej aktivity chimérickej protilátky 13239 s neutralizačnou aktivitou
infliximab in vitro 79
Analýza aktivity chimérickej protilátky 13239 in vivo 80
5. Návrh, výroba a charakterizácia selektívneho tnf blokátora produkovaného bunkami monocytovo-makrofágového radu 82
Molekulárne klonovanie, expresia a purifikácia bišpecifických protilátok 82
Interakcia protilátok A9 a mA9 s rekombinantným ľudským TNF 86
Protilátky A9 a rA9 blokujú TNF-dependentnú cytotoxicitu in vitro 87
Analýza väzby protilátok A9 a tA9 na povrch makrofágov prostredníctvom interakcie s
povrchová molekula F4/80 89
Retencia endogénne produkovaného ľudského TNF na povrchu makrofágov
bišpecifická protilátka A9 93
6. Fyziologicky významné selektívne blokovanie tnf produkovaného bunkami monocytovo-makrofágovej série in vivo 96
Porovnávacie vyhodnotenie účinnosti cieleného blokovania TNF produkovaného bunkami monocytársko-makrofágového radu a systémového blokovania TNF na modeli akútnej
hepatotoxicita 96
Záver 99
Referencie 100
Úloha TNF v patogenéze reumatoidnej artritídy a iných autoimunitných ochorení
Prvá skúsenosť s anticytokínovou terapiou bola uskutočnená v roku 1985, keď bolo myšiam injikované polyklonálne anti-NF králičie sérum, ktoré zabránilo rozvoju letálnej hepatotoxicity vyvolanej podávaním LPS. Podobné výsledky sa získali u opíc: paviány, ktorým bola injikovaná myšacia monoklonálna protilátka proti ľudskému TNF, prežili po intravenóznej injekcii letálnej dávky E. coli [104].
Prvý terapeutický blokátor TNF bol vyvinutý z vysoko afinitnej myšacej monoklonálnej protilátky A2 odvodenej od myší imunizovaných ľudským TNFa. Pretože protilátky iných druhov majú významné rozdiely v sekvencii aminokyselín, nie sú vhodné na dlhodobé terapeutické použitie u ľudí. Preto boli génovým inžinierstvom myšie konštantné domény ťažkého a ľahkého reťazca nahradené ľudskými. Variabilné oblasti, ktoré viažu antigén, zostali nezmenené. Takéto protilátky sa nazývajú chimérické. Následne táto prvá terapeutická anti-TNF protilátka dostala medzinárodný nechránený názov – infliximab.
Jednou z najzreteľnejších aplikácií antiNF terapie bola liečba sepsy. Klinické štúdie však nepreukázali významné výsledky, čo je zjavne spôsobené tým, že v čase, keď sa vyvinie klinický obraz sepsy, už prebiehajú nezvratné signálne kaskády.
V tom čase už bolo nazhromaždených veľa faktov, ktoré naznačujú zapojenie TNF do patogenézy reumatoidnej artritídy, takže toto ochorenie bolo vybrané ako ďalší potenciálny cieľ antiNF terapie. Pilotné štúdie infliximabu pri reumatoidnej artritíde ukázali sľubné výsledky a ďalšie randomizované, dvojito zaslepené štúdie potvrdili účinnosť antiNF terapie pri liečbe autoimunitných ochorení. Po opakovaných injekciách sa však u niektorých pacientov vytvorili protilátky špecifické pre myšacie aminokyselinové sekvencie vo variabilných doménach, čo znížilo účinnosť terapie.
Dvojito zaslepená, randomizovaná štúdia ukázala, že infliximab má synergický účinok s nízkymi dávkami metotrexátu, cytotoxického lieku používaného na monoterapiu pri RA. V kombinácii sú tieto dva lieky účinnejšie a imunogenicita infliximabu je znížená. Nasledujúce klinické štúdie fázy II/III viedli k schváleniu infliximabu na liečbu RA.
Mechanizmus účinku infliximabu je spôsobený najmä väzbou solubilného TNF v systémovom obehu a v miestach lokálnej hyperexpresie (synoviálna dutina pri RA). Ale okrem toho je infliximab schopný viazať sa na transmembránovú formu TNF a spôsobiť lýzu buniek, ktoré ho nesú na svojom povrchu, prostredníctvom mechanizmu cytotoxicity závislej od protilátok.
AntiNF terapia prerušuje patologickú signalizačnú kaskádu a vedie k zníženiu zápalovej odpovede, no navyše dokáže vyvážiť dysregulovaný imunitný systém. Na pozadí zavedenia inhibítorov TNF sa rovnováha T-efektorových a T-regulačných buniek posúva.
AntiNF terapia nie je etiotropnou terapiou a teoreticky by sa mala používať počas celého života pacienta, avšak v niektorých prípadoch je možné dosiahnuť stabilnú remisiu, ktorá pretrváva aj po vysadení antiNF terapie.
Blokátory TNF preukázali svoju účinnosť pri liečbe iných autoimunitných a zápalových ochorení: ukázalo sa, že TNF hrá významnú úlohu v patogenéze Crohnovej choroby – nadmerne sa exprimuje v zapálených oblastiach čreva. Predbežný úspech v liečbe refraktérnej Crohnovej choroby infliximabom bol neskôr potvrdený v randomizovaných klinických štúdiách, čo viedlo k schváleniu infliximabu aj pre toto ochorenie.
Patogenéza ankylozujúcej spondylitídy (Bekhterevova choroba), ďalšieho chronického systémového autoimunitného ochorenia postihujúceho prevažne kĺby, je tiež spôsobená nadmernou expresiou TNF. Klinické skúšky infliximabu boli úspešné aj pri tomto ochorení. Okrem toho antiNF terapia preukázala vysokú účinnosť pri liečbe psoriázy a psoriatickej artritídy.
Doteraz boli infliximab a iné blokátory TNF schválené ako terapeutické činidlá pre nasledujúce autoimunitné ochorenia: reumatoidná artritída, juvenilná idiopatická artritída, ankylozujúca spondylitída, Crohnova choroba, ulcerózna kolitída, psoriáza, psoriatická artritída. Okrem toho antagonisty TNF preukázali pozitívne výsledky pri liečbe sarkoidózy, Wegenerovej granulomatózy, Behçetovej choroby a iných chronických ochorení.
Náznaky, že TNF hrá úlohu v patogenéze roztrúsenej sklerózy, podporili laboratórne pokusy na zvieratách. Zavedenie TNF zhoršilo symptómy experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy u potkanov a zavedenie antiNF protilátok zabránilo rozvoju tohto ochorenia.
Klinické štúdie pri roztrúsenej skleróze s infliximabom a ďalším blokátorom TNF, lenerceptom (rozpustný TNFR1), však nepriniesli významnú klinickú odpoveď. Navyše u niektorých pacientov
Modelové autoimunitné ochorenie, ktorého patogenéza je podobná ako pri roztrúsenej skleróze. došlo k nárastu klinické príznaky ochorenia a zvýšenie celularity a hladiny imunoglobulínov v mozgovomiechovom moku, zvýšenie počtu ložísk pri magnetickej rezonancii.
Úspech infliximabu dal impulz vývoju nových molekúl schopných blokovať prenos signálu cez TNFR. Okrem toho myšie sekvencie vo variabilných doménach ťažkého a ľahkého reťazca infliximabu spôsobili u niektorých pacientov produkciu sekundárnych protilátok, ktoré blokovali účinok infliximabu a spôsobili, že pacienti boli odolní voči liečbe. Na prekonanie tohto obmedzenia bola zvolená cesta na vytvorenie inhibítorov s plne ľudskými aminokyselinovými sekvenciami.
Doteraz boli okrem infliximabu na klinické použitie schválené štyri antagonisty TNF (pozri obrázok 2):
Etanercept je rekombinantný inhibítor TNF skonštruovaný z rozpustného TNFR2. Jeho vývoj bol založený na údajoch, že v ľudskom tele je prítomná rozpustná forma druhého TNF receptora. Deskvamovaný metaloproteázami je TNFR2 ďalším článkom v regulácii aktivity TNF. Etanercept je dimér extracelulárnej časti TNFR2 geneticky fúzovaný s Fc fragmentom imunoglobulínu IgG1. Väzba na konštantnú oblasť protilátky významne zvyšuje systémový polčas liečiva recykláciou proteínu cez FcRn receptor. Neutralizačná aktivita fúzneho proteínu bola preukázaná v experimentoch in vitro aj in vivo a neskôr potvrdená v klinických štúdiách u pacientov s reumatoidnou artritídou.
Pri liečbe zápalového ochorenia čriev však etanercept na rozdiel od infliximabu nepreukázal terapeutickú účinnosť. Experimentálny blokátor TNF oneercept, odvodený od iného receptora TNF, TNFR1 (p55), napriek povzbudivým pilotným klinickým skúškam v randomizovanej, placebom kontrolovanej, dvojito zaslepenej štúdii, tiež nepreukázal žiadnu účinnosť pri liečbe Crohnovej choroby. Štúdia in vitro skúmajúca T-lymfocyty z lamina propria pacientov s Crohnovou chorobou ukázala, že kým infliximab aj etanercept blokujú TNF, iba infliximab sa viaže na T bunky v lézii a indukuje v nich apoptózu. To môže vysvetliť rozdiel v účinnosti blokátorov na báze protilátok a blokátorov na báze rekombinantných receptorov pri zápalovom ochorení čriev.
Štúdia interakcie Vhh41 a ľudského TNF pomocou povrchovej plazmovej rezonancie
Genetický konštrukt kódujúci bišpecifickú protilátku A9 bol zostavený 4-primérovou GAP reakciou podobnou reakcii opísanej vyššie pre gén jednoreťazcovej protilátky ahT-4. Výsledná sekvencia pozostávala z: jednodoménového antiNF protilátkového génu, potom sekvencie kódujúcej (Gly4Ser)3 druh linkeru a jednoreťazcového anti-P4/80 protilátkového génu (s láskavým dovolením S. Gordona a M. Stacey). Reštrikčné rozpoznávacie miesta Ncol a Xhol boli zahrnuté v sekvencii dopredných a reverzných primérov, v danom poradí. Po reštrikčnom PCR produkte a jeho klonovaní do expresného vektora pET-28b (Novagen) bola sekvencia kódujúca polyhexidínovú značku na 3 konci v rovnakom čítacom rámci. Aby sa získala kontrolná protilátka wA9, mutantný anti-G4/80 scFv gén obsahujúci glycín-serínové inzerty namiesto CDR sekvencií bol syntetizovaný de-novo (Geneart, Nemecko) a klonovaný namiesto natívneho anti-F4/80 génu (pozri obr. 31B).
Expresné vektory nesúce inzerty kódujúce A9 a shA9 sa použili na transformáciu buniek E. coli kmeňa Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Najlepšie produkčné klony sa vybrali imunoblotovaním kolónií s použitím peroxidázy konjugovanej s niklom (Pierce, 15165). Bakteriálne kultúry boli pestované v LB médiu obsahujúcom 50 cg/ml karbenicilínu (Sigma-C1389) a 50 cg/ml chloramfenikolu (Sigma-C1863) do logaritmickej fázy a potom bola expresia indukovaná 0,2 mM IPTG. Po 4 hodinách sa kultúry podrobili centrifugácii pri 3200 g počas 30 minút. Pelety sa zmrazili a potom sa resuspendovali v lyzovacom pufri (50 mM TrisHCl, 300 MMNaCl, 5 % glycerol, 0,5 % detergent Triton X-100, 10 000 U/ml lyzozýmu, 10 mM P-merkaptoetanol) a potom sa dezintegrovali pomocou ultrazvukového homogenizátora. Lyzáty sa centrifugovali pri 17 000 g počas 40 minút, supernatanty sa zozbierali a prefiltrovali cez filter s priemerom pórov 0,22 cm. Bišpecifické protilátky A9 a tA9 sa purifikovali z vyčírených supernatantov na chromatografickej kolóne obsahujúcej agarózu konjugovanú s kyselinou Ni-nitrilooctovou (Invitrogen R90115). Afinitná chromatografia sa uskutočnila podľa protokolu výrobcu. Výsledný eluát sa skoncentroval, dialyzoval proti fosfátom tlmenému fyziologickému roztoku, nasledovala filtrácia cez 0,22 um filter. Koncentrácia proteínu v roztoku sa merala pomocou reakcie s kyselinou 2,2-bicinchonínovou (súprava PIERCE 23225) podľa protokolu výrobcu. Homogenita výsledného prípravku bola testovaná elektroforézou v 15% polyakrylamidovom géli v prítomnosti dodecylsulfátu sodného, po čom nasledovalo farbenie Coomassie.
Interakcia protilátok A9 a mA9 s rekombinantným ľudským TNF pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie.
Porovnanie afinity a kinetiky interakcie protilátok A9 a mA9 s rekombinantným ľudským TNF sa uskutočnilo na prístroji ProteOn XPR36 (Bio-Rad). V priebehu merania všetkých interakcií bol použitý fosfátom pufrovaný fyziologický roztok pH = 7,4, do ktorého bol pridaný detergent Tween 20 v koncentrácii 0,005 %, povrchová teplota čipu bola 25 C. Rekombinantný ľudský TNF bol vyjadrený v E coli podľa vyššie opísaného spôsobu. Protilátky A9 a tA9 v koncentrácii 50 nM boli imobilizované cez aminoskupinu na povrchu biočipu s modifikovaným alginátovým polymérnym povrchom (Bio-Rad 176-5011). Potom sa analyt (ľudský TNF) v piatich dvojnásobne klesajúcich koncentráciách (50-3 nM) aplikoval do piatich paralelných kanálov. Pufor neobsahujúci žiadne protilátky sa zaviedol do šiesteho kanála na normalizáciu. Analýza prijatých senzogramov sa uskutočnila v programe ProteOn Manager (Bio-Rad) s použitím Langmuirovho modelu.
V experimentoch s peritoneálnymi makrofágmi boli bunky peritoneálnej dutiny izolované z myší divokého typu (C57BL/6) a okamžite zafarbené pomocou protilátok konjugovaných s fluorochrómom. Na získanie makrofágov kostnej drene Kostná dreň sa izoloval, potom sa bunky kultivovali 10 dní v upravenom médiu (získanom na línii L929), potom sa bunky odstránili z plastu ľadovo studeným fosfátovým pufrom.
Pred farbením bol Fc-gama receptor blokovaný, potom boli bunky inkubované s A9 alebo tA9 protilátkami alebo pufrom, potom boli bunky premyté a zafarbené jedným z troch spôsobov: 1) polyklonálne králičie protilátky proti hTNF-VnH, potom s sekundárne protilátky proti králičiemu IgG konjugovanému s fluorochrómom. 2) monoklonálne myšie protilátky proti hexahistidínovej sekvencii (Novagen - 70796), potom so sekundárnymi protilátkami proti myšiemu IgG konjugovanému s fluorochrómom. 3) k bunkám bol pridaný rekombinantný ľudský TNF a následne monoklonálne antiNF protilátky (Miltenyi Biotec - klon: cA2) označené fluorochrómom.
Okrem toho boli bunky zafarbené protilátkami anti-P4/80 a anti-CD 1 lb konjugovanými s fluorochrómami. Vzorky boli analyzované buď na prístroji F ACS Aria (BDBiosciences) alebo Guava EasyCyte 8HT (Millipore) a potom spracované pomocou softvéru FlowJo (Treestar Inc.).
Hodnotenie schopnosti bišpecifickej protilátky A9 zadržiavať ľudský TNF na povrchu makrofágov.
Peritoneálne makrofágy z myší produkujúcich ľudský TNF sa izolovali a naočkovali v množstve 100 000 buniek na jamku na 96-jamkové kultivačné platne. Bunky sa inkubovali 2 hodiny pri 37 °C, 5 % C02, potom sa nepripojené bunky premyli teplým fosfátovým pufrom. Bunky sa potom inkubovali cez noc pri 37 °C, 5 % C02. Po premytí 200 ul teplého média DMEM boli bunky inkubované s protilátkami A9 v koncentrácii 2 ug/ml alebo s médiom DMEM počas 30 minút pri 37 °C. Po ďalšom premytí boli bunky stimulované LPS (Sigma, L2630) v koncentrácii 100 ng/ml. Po 4 hodinách sa supernatanty kultúr odobrali a merala sa koncentrácia ľudského TNF pomocou súpravy ELISA (eBioscience, 88-7346) podľa protokolu výrobcu.
Kostná dreň z myší produkujúcich ľudský TNF bola izolovaná, potom boli bunky kultivované počas 10 dní v upravenom médiu (získanom na línii L929), potom boli bunky odstránené z plastu ľadovo studeným fosfátovým pufrom. Spočítal sa počet živých buniek a tie sa umiestnili na 96-jamkové platne v koncentrácii 50 000 buniek/jamku. Potom sa k bunkám pridalo 250 uM protilátky A9 alebo protilátky s jednou doménou hTNF-VffH alebo prázdne médium (DMEM). Bunky boli inkubované s protilátkami počas 30 minút. Jamky sa potom premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom. Potom bola produkcia TNF stimulovaná LPS (Sigma - L2630) v koncentrácii 100 ng/ml. Po 4 hodinách boli supernatanty odobraté, koncentrácia TNF v nich bola meraná použitím cytotoxického testu na línii myšieho fibrosarkómu L929 podľa protokolu podobného tomu, ktorý je opísaný vyššie.
Štúdium biologických vlastností fluorescenčného senzora Vhh41-KTNFin vitro a in vivo
Na základe experimentálnych údajov získaných na myšacích líniách, v ktorých je gén Tnf deletovaný v samostatných bunkových populáciách, bola formulovaná hypotéza o možných rôznych funkciách TNF produkovaných rôznymi typmi imunocytov. Nedávno sa teda ukázalo, že TNF produkovaný T-lymfocytmi, ale nie myeloidnými bunkami, má jedinečnú ochrannú funkciu v modeli experimentálnej infekcie tuberkulózy. Okrem toho boli v našom laboratóriu získané údaje poukazujúce na patogénne vlastnosti TNF z myeloidných buniek pri autoimunitných ochoreniach. Terapeuticky aplikovaná úplná blokáda PMB tieto vlastnosti nezohľadňuje. V rámci vypracovania tejto hypotézy bola zvolená špecifická inhibícia TNF produkovaného bunkami monocytovo-makrofágovej série, ktorá by mohla mať významnú výhodu oproti systémovej blokáde tohto cytokínu. Predovšetkým neporušený signál z TNF produkovaný B- a T-lymfocytmi by mohol znížiť výskyt vedľajších účinkov a navyše urobiť antiNF terapiu účinnou pri tých ochoreniach, pri ktorých blokátory TNF predtým nepreukázali klinickú účinnosť alebo dokonca spôsobili zvýšenie symptómov. Okrem toho by tento prístup mohol potenciálne znížiť požadovanú dávku prostredníctvom cieleného dodávania do produkčných buniek.
Na testovanie tohto predpokladu sme skonštruovali a otestovali bišpecifickú protilátku, ktorá sa viaže na jednu časť povrchu makrofágov v dôsledku interakcie s transmembránovou molekulou F4/80 a druhá špecificita zachytáva a blokuje nimi produkovaný TNF.
Molekulárne klonovanie, expresia a purifikácia bišpecifických protilátok. Bišpecifická protilátka, selektívny blokátor makrofágového TNF, bola nazvaná A9. Jednodoménová blokujúca antiNF protilátka hTNF-VffH a jednoreťazcová protilátka (scFv) proti makrofágovému povrchovému markeru F4/80 (láskavo poskytli S. Gordon (Oxford University, UK) a M. Stacy (University of Leeds, UK) boli použité na vytvorenie genetického konštruktu, ktorý ho kóduje. Sekvencie kódujúce obe protilátky boli amplifikované polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) a klonované do expresného vektora tak, aby boli v rovnakom čítacom rámci, a nukleotidová sekvencia kódujúca flexibilný glycín-serín medzi nimi vznikol linker (GSGGGGSG) Sekvencia kódujúca histidínový hexamér sa nachádza na C-konci sekvencie pre následnú purifikáciu proteínu (obr. 31).
Návrh bišpecifickej protilátky A9, schematické znázornenie mechanizmu jej účinku, štruktúra genetických konštruktov kódujúcich bišpecifickú protilátku A9 a kontrolný systémový blokátor TNF, protilátka tA9. (A) Bišpecifická protilátka A9 pozostáva z protilátky s jednou doménou (VHH) proti ľudskému TNF a jednoreťazcovej protilátky (scFv) proti povrchovej molekule F4/80 exprimovanej na monocytoch a makrofágoch. (B) Princíp selektívneho blokovania TNF produkovaného makrofágmi: A9 sa viaže na povrch makrofágov a zachytáva TNF uvoľnený z ich povrchu, čím bráni jeho vstupu do systémovej cirkulácie. (B) Schéma genetického konštruktu bišpecifickej protilátky A9 a kontrolného systémového blokátora TNF, tA9. Po jednodoménom antiNF protilátkovom géne nasleduje sekvencia kódujúca flexibilný glycín-serínový linker a potom jednoreťazcový anti-F4/80 protilátkový gén. Potom nasleduje sekvencia kódujúca histidínový hexamér na afinitnú purifikáciu. Kontrolná protilátka tA9 má podobnú sekvenciu, s výnimkou toho, že 6 hypervariabilných oblastí protilátky anti-P4/80 je nahradených sekvenciami typu (Gly3Ser)n, čo zabraňuje protilátke naviazať sa na povrch makrofágov a mení ju na systémový inhibítor TNF.
Na štúdium účinkov špecifického blokovania TNF produkovaného makrofágmi bol potrebný kontrolný systémový blokátor. Aby sa predišlo účinkom spojeným s rozdielmi v afinite protilátok, rozhodlo sa použiť blokátor, ktorý má podobné A9 TNF-väzbové miesto. A aby sa vylúčil vplyv iných faktorov, najmä izoelektrického bodu a molekulovej hmotnosti, ktoré môžu ovplyvniť polčas rozpadu, kontrolná protilátka by mala byť v primárnej aminokyselinovej sekvencii čo najbližšie k hodnotenej sekvencii. Preto sme skonštruovali kontrolnú protilátku - tA9, ktorá má rovnakú štruktúru a aminokyselinovú sekvenciu ako A9, okrem toho, že 6 jej hypervariabilných oblastí v anti-P4/80 scFv bolo nahradených sekvenciami typu (Gly3Ser)n, rovnaké dĺžky ako pôvodné CDR oblasti (pozri obr. 31B).
Obe protilátky boli exprimované v bakteriálnom systéme a purifikované afinitnou chromatografiou.
Veľkosť protilátky A9, určená elektroforetickou pohyblivosťou a HPLC dátami, zodpovedala vypočítanej molekulovej hmotnosti 45 kDa (obr. 32). chromatografia. Vľavo - hodnoty molekulovej hmotnosti bielkovín. (B) Chromatogram bišpecifickej protilátky A9 (označené červenou farbou) superponovaný na chromatogram markerov molekulovej hmotnosti. (B) Funkcia doby prechodu molekuly ako funkcia molekulovej hmotnosti. Vypočítaná molekulová hmotnosť bišpecifickej protilátky A9 bola 43,4 kDa.
Interakcia protilátok A9 a tA9 s rekombinantným ľudským TNF. Kinetika interakcie protilátok A9 a mA9 s rekombinantným ľudským TNF bola meraná povrchovou plazmónovou rezonanciou. Na tento účel boli obe protilátky v koncentrácii 50 nM imobilizované na povrchu senzorového čipu, potom bol ako analyt aplikovaný rekombinantný ľudský TNF v sériovom riedení 50-3 nM a kinetika interakcie bola meraná na ProteOn. Prístroj XPR36. Obe protilátky vykazovali vysokú afinitu: Kd A9 a tA9 bola 85 a 95 pM, v danom poradí. To potvrdzuje, že zavedené mutácie neovplyvnili väzbu TNF. Okrem toho obe protilátky mali podobné parametre rýchlosti väzby (Kforward, on-rate) a disociačnej rýchlosti (Kreverse, off-rate) - znázornené na obr. 33 a v Tab. 3. Pomalá rýchlosť disociácie by mala umožniť protilátke A9 udržať si naviazaný TNF.
Výroba a charakterizácia novej rekombinantnej jednodoménové protilátky, ktorá sa špecificky viaže na ľudský TNF, ale neblokuje jeho biologickú aktivitu
Interakčná kinetika protilátok A9 a mA9 s rekombinantným ľudským TNF sa merala povrchovou plazmónovou rezonanciou. Na tento účel boli obe protilátky v koncentrácii 50 nM imobilizované na povrchu senzorového čipu, potom bol ako analyt aplikovaný rekombinantný ľudský TNF v sériovom riedení 50-3 nM a kinetika interakcie bola meraná na ProteOn. Prístroj XPR36. Obe protilátky vykazovali vysokú afinitu: Kd A9 a tA9 bola 85 a 95 pM, v danom poradí. To potvrdzuje, že zavedené mutácie neovplyvnili väzbu TNF. Okrem toho mali obe protilátky podobné parametre rýchlosti väzby (Kforward, on-rate) a disociačnej rýchlosti (Kreverse, off-rate) - znázornené na obr. 33 a v Tab. 3. Pomalá rýchlosť disociácie by mala umožniť protilátke A9 udržať si naviazaný TNF.
Kinetika interakcie bišpecifickej protilátky A9 a kontrolnej protilátky tA9 s rekombinantným ľudským TNF. (A) Sú znázornené interakčné krivky (senzogramy) rekombinantného ľudského TNF v koncentráciách 50 nM - 3 nM so senzorovým čipom, na ktorom boli imobilizované A9 bišpecifická protilátka a kontrolná tA9 protilátka. Os x ukazuje čas v sekundách, ordináta ukazuje posun rezonančného uhla v konvenčných jednotkách (AU). (B) Pre každú skupinu senzogramov sa vypočítala väzbová rýchlosť (op-rate), disociačná rýchlosť (off-rate) a disociačná konštanta (Kd). Výsledné priemerné hodnoty, ako aj štandardná odchýlka (SD) sú vynesené do diagramu izoafinity. Diagonálne čiary zodpovedajú uvedeným hodnotám disociačnej konštanty.
Na vyhodnotenie relatívnej aktivity protilátky A9 pri inhibícii biologických účinkov TNF sa uskutočnil cytotoxický test na línii myšieho fibrosarkómu L929. Sériové riedenia protilátok A9 a mA9 sa pridali do konštantných koncentrácií rekombinantného ľudského TNF a aktinomycínu-D. Podľa získaných údajov majú protilátky A9 a rA9 podobnú antiNF aktivitu (obr. 34 A). Okrem toho sa potvrdilo, že aktivita bišpecifickej protilátky A9 zodpovedá aktivite jednodoménovej anti-NF protilátky hTNF-VffH, ktorá je súčasťou A9 a mA9 (obr. 34 B). 10 10 10
AntiNF aktivita bišpecifickej protilátky A9, kontrolnej protilátky mA9 a protilátky s jednou doménou hTNF-VffH. (A) Porovnanie aktivity bišpecifickej protilátky A9 a kontrolnej protilátky tA9. Je znázornená krivka prežitia buniek myšieho fibrosarkómu L929 pri súčasnej expozícii konštantnej dávke ľudského TNF a klesajúcim dávkam protilátok A9 a tA9. (B) Porovnanie aktivity bišpecifickej protilátky A9 a protilátky s jednou doménou hTNF-VnH. Krivka prežitia buniek myšacieho fibrosarkómu L929 je znázornená pri súčasnej expozícii konštantnej dávke ľudského TNF a klesajúcim dávkam protilátok A9 a hTNF-VHH. Porovnanie sa uskutočnilo v molárnych koncentráciách, aby sa vylúčili účinky rozdielov v molárna hmota na aktivitu protilátky, ktorá sa má stanoviť.
Analýza väzby protilátok A9 a mA9 na povrch makrofágov prostredníctvom interakcie s povrchovou molekulou F4/80.
Schopnosť bišpecifickej protilátky A9 špecificky sa viazať na povrch makrofágov bola hodnotená prietokovou cytometriou. Na tento účel sa bunky izolované z peritoneálnej dutiny inkubovali s protilátkami A9, potom sa zafarbili na makrofágové markery CD1 lb a F4/80 a súčasne sa uskutočnilo špecifické farbenie na bišpecifickú protilátku A9 prostredníctvom protilátok proti VHH. OR protilátky proti polyhistidínovej značke. Vzorky sa potom podrobili prietokovej cytometrii a analýze.
Tieto experimenty ukázali, že bišpecifická protilátka A9 bola schopná viazať sa na povrch peritoneálnych buniek exprimujúcich F4/80 a CD1 lb na svojom povrchu (monocyty a makrofágy) (obr. 35 A - D). Zároveň sa A9 neviaže na bunky peritoneálnej dutiny, ktoré tieto markery nemajú (hlavne lymfocyty) (obr. 35 E a F). Zníženie úrovne paralelného anti-F4/80 farbenia s pridaním protilátky A9 v dôsledku konkurencie dvoch protilátok o väzbu na cieľ potvrdzuje, že A9 špecificky interaguje s touto konkrétnou molekulou na bunkovom povrchu (obr. 35 G a 3).
Používa sa aj názov Mac-1. Základný prvok zložky C3 receptora komplementového systému. U myší sa exprimuje na monocytoch, makrofágoch a mikrogliálnych bunkách. bišpecifická protilátka
Bunky peritoneálnej dutiny boli inkubované s bišpecifickou protilátkou A9 alebo bez nej (zobrazené červenou farbou) alebo bez nej (zobrazené modrou farbou) a potom zafarbené fluorescenčne značenými protilátkami proti povrchovým markerom špecifickým pre monocytárne-makrofágové bunky, ako aj špecifickými protilátkami pre A9. Potom boli získané vzorky analyzované prietokovou cytometriou. (A, C, E, G) farbenie prostredníctvom protilátok proti doméne VHH. (B, D, F, 3) farbenie prostredníctvom protilátok proti polyhexidínovej sekvencii. (A, B) Bišpecifická protilátka A9 sa viaže na bunky vybrané pre vysokú expresiu F4/80 a CD1 lb (makrofágy). Na zobrazenom histograme ukazuje horizontálna os hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli pri A9, vertikálna os ukazuje normalizovanú frekvenciu udalosti. (C, D) to isté vo forme rozptylového histogramu. Horizontálna os ukazuje hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli pri A9, vertikálna os ukazuje hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli pri F4/80. (E,E)-bišpecifická protilátka A9 sa neviaže na bunky peritoneálnej dutiny, ktoré neexprimujú F4/80 a CD1 lb (lymfocyty). Na zobrazenom histograme ukazuje horizontálna os hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli pri A9, vertikálna os ukazuje normalizovanú frekvenciu udalosti. (G, 3) -inkubácia s bišpecifickou protilátkou A9 znižuje intenzitu farbenia o F4/80. Na zobrazenom histograme ukazuje horizontálna os hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli pri F4/80, vertikálna os ukazuje normalizovanú frekvenciu výskytu udalosti.
Makrofágy kostnej drene boli inkubované s bišpecifickou protilátkou A9 (zobrazené červenou), bez nej (zobrazené modrou farbou) alebo s kontrolnou protilátkou tA9 (zobrazené čiernou farbou) a potom zafarbené protilátkami špecifickými pre A9/mA9. Získané vzorky boli analyzované prietokovou cytometriou. (A) Bišpecifická protilátka A9 sa špecificky viaže na makrofágy kostnej drene. Na zobrazenom histograme ukazuje horizontálna os hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli pri A9, vertikálna os ukazuje normalizovanú frekvenciu udalosti. (B) Kontrolná protilátka mA9 nie je schopná viazať sa na makrofágy kostnej drene. Na zobrazenom histograme horizontálna os ukazuje hodnotu fluorescencie vo farbiacom kanáli na wA9, vertikálna os ukazuje normalizovanú frekvenciu výskytu udalosti.
Okrem toho sa v ďalších cytofluorometrických experimentoch ukázalo, že protilátka A9, keď je pripojená k povrchu makrofágov, je schopná súčasne viazať exogénne pridaný ľudský TNF (obr. 37). To potvrdzuje, že obe podjednotky bišpecifickej protilátky sú funkčne aktívne súčasne a že väzba dvoch antigénov súčasne je stéricky možná.
Bunky peritoneálnej dutiny boli inkubované s bišpecifickou protilátkou A9 alebo bez nej (zobrazené červenou farbou) alebo bez nej (zobrazené modrou farbou), potom s rekombinantným ľudským TNF, potom boli zafarbené fluorescenčne značenými protilátkami proti povrchovým markerom špecifickým pre monocyty-makrofágy bunky, ako aj protilátky špecifické pre ľudský TNF. Získané vzorky boli analyzované prietokovou cytometriou. (A) Bišpecifická protilátka A9 schopná zadržiavať ľudský TNF na povrchu makrofágov (bunky vybrané na vysokú expresiu F4/80 a CD1 lb). Na zobrazenom histograme horizontálna os ukazuje hodnotu fluorescencie v kanáli TNF farbenia a normalizovaná frekvencia udalostí je vynesená pozdĺž vertikálnej osi. (B) Rovnaké údaje vo forme rozptylového histogramu. Horizontálna os ukazuje hodnoty fluorescencie v kanáli farbenia TNF, vertikálna os ukazuje hodnoty fluorescencie v kanáli farbenia F4/80.
Metódy genetického inžinierstva, najmä klonovanie jednotlivých génov alebo ich častí, ako aj sekvenovanie DNA, umožnili výrazne zlepšiť metodiku mutagenézy, čím sa odstránili hlavné nedostatky klasických metód indukcie mutácií v genómoch. Klasická genetická analýza predpokladá účinok mutagénneho faktora in vivo na celý genóm, čo vedie k náhodným mutáciám, často viacnásobným, čo značne komplikuje identifikáciu mutantov. Identifikácia mutantov sa uskutočňuje podľa zmenených fenotypových znakov a povaha mutácie sa môže určiť po sekvenovaní DNA. Moderná lokalizovaná mutagenéza v skutočnosti zahŕňa reverzné akcie: najprv sa gén alebo jeho požadovaný segment naklonuje, jeho štruktúra sa určí počas sekvenovania a potom sa in vitro vykonajú požadované zmeny v jeho zložení. Následky indukovanej mutácie sa zisťujú po zavedení mutantného génu do pôvodného organizmu.
Najjednoduchším variantom lokalizovanej mutagenézy je ošetrenie klonovaného fragmentu DNA jedným z mutagénnych faktorov, avšak takáto expozícia bude mať za následok aj náhodné zmeny v štruktúre fragmentu. Spoľahlivejšie a častejšie používané metódy lokalizovanej mutagenézy sa uskutočňujú bez použitia mutagénnych faktorov. Medzi typmi mutácií prevládajú delécie, inzercie a substitúcie nukleotidov.
vymazania. Tieto typy mutácií sú produkované endonukleázami lokalizovanou mutagenézou. Používajú sa reštriktívne aj nešpecifické endonukleázy. Najjednoduchším použitím reštrikčných enzýmov je štiepenie genómu reštrikčným enzýmom, ktorý zavádza niekoľko zlomov s tvorbou lepkavých koncov. Výsledné fragmenty sú opäť uzavreté do kruhu pomocou DNA ligázy, čo môže viesť k vytvoreniu molekúl, ktoré neobsahujú jeden zo segmentov DNA. Tento prístup vytvára veľké delécie a vo všeobecnosti sa používa v predbežných experimentoch na určenie funkcií relatívne veľkých úsekov klonovanej DNA.
Malé delécie sa získajú nasledovne. Klonovaný fragment sa štiepi vo vektore na vhodnom mieste reštrikčným enzýmom (obr. 21.1). Výsledná lineárna molekula sa ošetrí exonukleázou III, ktorá hydrolyzuje jedno vlákno v DNA,
počnúc od 3' konca. Výsledkom je súbor molekúl s jednovláknovými 5'-chvoskami rôznych dĺžok. Tieto konce sú hydrolyzované jednovláknovou DNA špecifickou S1 nukleázou a v DNA sa vytvárajú delécie. Je tiež možné použiť exonukleázu Bal 31, ktorá katalyzuje degradáciu oboch reťazcov, začínajúc od koncov lineárnych molekúl DNA. Priebeh nukleotických reakcií je regulovaný zmenou inkubačného času, teploty a koncentrácie enzýmu, čo vyvoláva tvorbu delécií rôznej dĺžky. Výsledné lineárne varianty s deléciou DNA sú často pred cyklizáciou vybavené linkermi, takže v oblasti delécie sú prítomné reštrikčné miesta. Existujú aj ďalšie modifikácie opísaných metód.
Vložky (vložky). Na získanie inzercií sa klonovaná DNA štiepi reštrikčným enzýmom alebo nešpecifickou endonukleázou a potom sa výsledné fragmenty ligujú v prítomnosti segmentu, ktorý sa má vložiť do DNA. Najčastejšie sa ako takéto segmenty používajú chemicky syntetizované polylinkery (kapitola 20).
Inzercie, podobne ako delécie, môžu narušiť integritu génu alebo štruktúru jeho regulačných oblastí, čo má za následok syntézu defektného proteínu (v prípade rozšírených delécií alebo posunu rámca, zvyčajne neaktívne) alebo zmeny v procese transkripcie génu. gén záujmu. Týmto spôsobom sa často získajú regulačné mutanty a skonštruujú sa exprimované vektory (kapitola 20).
Bodové mutácie . Tieto mutácie sú nukleotidové substitúcie. Na ich získanie možno použiť niekoľko prístupov: deaminácia cytozínu, zahrnutie nukleotidových analógov, nesprávne zahrnutie nukleotidov počas opravy medzery atď.
Prvý spôsob je založený na skutočnosti, že cytozínové zvyšky v jednovláknovej DNA môžu byť deaminované za vzniku uracilu pôsobením bisulfitových iónov. Jednovláknové oblasti v DNA sa zvyčajne získavajú v blízkosti reštrikčných miest, napríklad pôsobením exonukleázy III. Po ošetrení bisulfitom sa jednovláknové medzery vyplnia DNA polymerázou a konce sa ligujú. V miestach, kde sa počas deaminácie vytvoril uridylát namiesto cytidylátu, zaujme adenylát komplementárnu polohu a počas replikácie takejto molekuly bude pár GC nahradený párom AT.
Ďalším prístupom k indukcii substitúcií je ošetrenie klonovanej DNA nejakým reštrikčným enzýmom v prítomnosti etídiumbromidu, ktorý sa vkladá medzi roviny bázových párov a spôsobuje poruchy v duplexnej štruktúre. V dôsledku toho sa vytvorí iba jednovláknový zlom DNA. Na zlome jedného vlákna sa vytvorí malá medzera a potom sa vytvorí v prítomnosti DNA polymerázy, dATP, dGTP, dCTP a N-4-hydroxycytozíntrifosfátu namiesto dTTP. Hydroxycytozíntrifosfát je zahrnutý v reťazci namiesto tymidylátu, ale počas replikácie DNA sa rovnako dobre páruje s adenylátom aj guanylátom. V dôsledku inkorporácie guanylátu po ďalšom kole replikácie dôjde v tomto mieste k substitúcii AT → GC (obr. 21.2). Pretože pri tejto metóde sa náhrada nukleotidov uskutočňuje vo vnútri
reštrikčné miesto, je možné ľahko rozlíšiť medzi vektormi s pôvodnou sekvenciou a mutovanými. Na to stačí ošetriť ich reštrikčným enzýmom použitým v experimente: mutantné molekuly sa neštiepia.
Podobná metóda je založená na použití iba troch zo štyroch možných nukleotidov pri vypĺňaní jednovláknovej medzery DNA polymerázou. Vo väčšine prípadov sa enzým zastaví na mieste molekuly, kde narazí na komplementárny nukleotid k chýbajúcemu nukleotidu. Príležitostne sa však DNA polymeráza pomýli a obsahuje jeden z troch prítomných nukleotidov. To vedie k tvorbe kruhových molekúl, ktoré obsahujú nepárové nekomplementárne dusíkaté bázy. Keď sa takéto vektory zavedú do bakteriálnych buniek, niektoré z molekúl takéto poškodenie opravia. Výsledkom je, že v polovici molekúl sa po replikácii obnoví pôvodná sekvencia a v druhej polovici sa zafixuje mutácia. Mutantné molekuly možno rozlíšiť vyššie opísaným spôsobom.
Miestne špecifická mutagenéza. Metódy lokalizovanej mutagenézy sa vyznačujú tým, že miesta, kde dochádza k mutáciám, sú vybrané náhodne. Technika miestne špecifickej mutagenézy zároveň umožňuje zaviesť mutácie do presne definovanej oblasti génu. Toto sa uskutočňuje pomocou syntetických (získaných chemickou syntézou) oligonukleotidov s danou sekvenciou. Spôsob je vhodný v tom, že nevyžaduje prítomnosť vhodných reštrikčných miest. Metóda je založená na tvorbe heteroduplexov medzi syntetickým oligonukleotidom obsahujúcim mutáciu a komplementárnou jednovláknovou DNA vo vektore.
Postupujte nasledovne. Syntetizuje sa malý oligonukleotid (8-20 monomérov), ktorý je komplementárny k časti génu, v ktorej chcú získať mutáciu. Ako súčasť oligonukleotidu centrálny región umožňujú jednu alebo viac nukleotidových substitúcií. Skúmaný gén alebo jeho fragment sa klonuje do vektora založeného na fágu M13, aby sa získala kruhová jednovláknová rekombinantná DNA. Produkujte zmiešanie a hybridizáciu rekombinantných vektorov s oligonukleotidmi. Oligonukleotid hybridizuje s komplementárnou oblasťou, zatiaľ čo nekomplementárne nukleotidy zostávajú nepárové. Oligonukleotid pôsobí ako primér v polymerázovej reakcii zahŕňajúcej DNA polymerázu in vitro. Krúžok je uzavretý ligázami. Výsledná kruhová molekula je zavedená do buniek E. coli, kde dochádza k čiastočnej oprave mutantných replikačných miest. Miera mutácií sa zvyčajne pohybuje od 1 do 50 %. Selekciu buniek obsahujúcich mutantné molekuly DNA je možné uskutočniť niekoľkými spôsobmi, pričom výhodou je metóda využívajúca rádioaktívne značený oligonukleotid, ktorý sa používa na mutagenézu. V tomto prípade tento nukleotid slúži ako sonda. Princíp použitia takejto sondy je založený na skutočnosti, že je plne komplementárna s mutantnou DNA a čiastočne komplementárna s DNA divokého typu. Je možné zvoliť také hybridizačné podmienky (predovšetkým teplotu), že hybridizácia značenej sondy bude stabilná len s mutantnou sekvenciou DNA, ktorú je možné detegovať rádioautografom.
Metóda miestne špecifickej mutagenézy je obzvlášť cenná, pretože umožňuje izolovať mutácie bez kontroly ich fenotypového prejavu. Táto metóda otvára nové možnosti pre štúdium funkcií génových regulačných elementov, umožňuje meniť „silu“ promótorov, optimalizovať väzbové miesta s ribozómami atď. Jednou z hlavných aplikácií tejto metodiky je proteínové inžinierstvo.
Proteínové inžinierstvo. Táto fráza sa vzťahuje na súbor metodologických techník, ktoré umožňujú rekonštrukciu molekuly proteínu cieleným zavedením vhodných mutácií do štruktúrneho génu (miestne špecifická mutagenéza) a následne požadovaných substitúcií aminokyselín v primárnej štruktúre proteínu.
Názorným príkladom konštrukcie aktívnejších proteínov sú experimenty Fershta a spolupracovníkov s enzýmom tyrozyl-tRNA syntetázou z baktérie Bacillus stearothermophilus. Analýza dôsledkov substitúcií aminokyselín v aktívnom centre tohto enzýmu viedla k záveru, že odstránenie skupín, ktoré tvoria slabé vodíkové väzby so substrátom, môže zlepšiť jeho afinitu k substrátu. Zistilo sa, že treonín-51 (zaberá 51. pozíciu v peptide) tvorí dlhú a slabú vodíkovú väzbu s kyslíkom ribózového kruhu, keď je naviazaný tyrozyladenylát. Zároveň sa zistilo, že prolín zaujíma rovnakú pozíciu v baktériách E. coli. Miestne špecifická mutagenéza génu, ktorý určuje štruktúru tyrozyl-tRNA syntetázy B. stearothermophilus, umožnila poskytnúť náhradu thr-51→pro-51 v peptide. V dôsledku toho sa väzba ATP v aktívnom centre enzýmu dramaticky zlepšila a jeho katalytická aktivita sa zvýšila 25-krát.
Ďalším rovnako významným príkladom proteínovej rekonštrukcie s praktickým významom je modifikácia subtilizínu z Bacillus amyloliquefaciens, uskutočnená Estelle et al. Subtilizíny sú serínové proteinázy vylučované bacilom do prostredia. Tieto enzýmy sú vyrábané vo veľkom meradle biotechnologickým priemyslom a sú široko používané v detergentných prípravkoch. Nevýhodou subtilizínov je prudký pokles proteolytickej aktivity pôsobením oxidačných činidiel, vrátane tých, ktoré sú obsiahnuté v pracích práškoch. Úlohou rekonštrukcie molekuly subtilizínu BPN bolo stabilizovať ju proti chemickej oxidácii.
V predbežných experimentoch sa zistilo, že v prítomnosti peroxidu vodíka subtilizín rýchlo znižuje aktivitu v dôsledku oxidácie zvyšku metionínu-222, ktorý sa mení na zodpovedajúci sulfoxid. Metódy miestne špecifickej mutagenézy zabezpečili nahradenie tohto metionínového zvyšku všetkými ostatnými 19 proteínovými aminokyselinami. Plazmidy s mutantnými génmi sa zaviedli do kmeňov s deléciami v zodpovedajúcich génoch a analyzovali sa vlastnosti produkovaných subtilizínov. Ukázalo sa, že mutanty so serínom a alanínom sú dostatočne stabilné voči pôsobeniu peroxidu222. Mutant obsahujúci zvyšok cysteínu-222 sa ukázal byť najaktívnejším, jeho špecifická aktivita prevyšovala špecifickú aktivitu kmeňa divokého typu o 38 %.
Podobným spôsobom bolo možné zvýšiť aktivitu b-interferónu. Medzi ďalšie úspechy proteínového inžinierstva možno menovať štúdie v objasňovaní transformačnej aktivity onkoproteínov; zmena termostability enzýmov, napríklad získanie termolabilného renínu a termostabilnej a-amylázy; zvýšenie účinnosti väzby inzulínu zodpovedajúcim plazmatickým membránovým receptorom v dôsledku nahradenia histidínu aspartátom v polohe 10 b-reťazca hormónu, ako aj mnoho ďalších príkladov. Veľké množstvo produktov proteínového inžinierstva už našlo praktické uplatnenie vo výrobných procesoch.
Vo vyššie diskutovaných peptidových knižniciach sú tieto peptidy kovalentne spojené s nosným proteínom. V tejto forme sú jedným zo zástupcov hybridných proteínov získaných genetickým inžinierstvom.
V inom prípade sa na získanie používajú hybridné proteíny vysoký stupeň expresia krátkych peptidov v bakteriálnych bunkách v dôsledku stabilizácie týchto peptidov v zložení hybridných proteínov. Fúzne proteíny sa často používajú na identifikáciu a čistenie ťažko detegovateľných rekombinantných proteínov. Napríklad pripojením -galaktozidázy ako reportérového proteínu na C-koniec študovaného proteínu je možné purifikovať rekombinantný proteín aktivitou -galaktozidázy, stanovením jeho antigénnych determinantov imunochemickými metódami. Spojením DNA fragmentov obsahujúcich otvorené čítacie rámce (ORF) s reportérovými proteínovými génmi je možné purifikovať takéto fúzne proteíny pre reportérovú proteínovú aktivitu a použiť ich na imunizáciu laboratórnych zvierat. Výsledné protilátky sa potom použijú na purifikáciu natívneho proteínu, ktorý zahŕňa rekombinantný polypeptid kódovaný ORF, a tým identifikujú klonovaný génový fragment.
Pomocou hybridných proteínov sa rieši aj inverzný problém klonovania neznámeho génu, proti ktorého proteínovému produktu existujú protilátky. V tomto prípade je knižnica klonov nukleotidových sekvencií reprezentujúcich ORF neznámych génov skonštruovaná vo vektoroch, ktoré umožňujú spojenie klonovaného ORF v rovnakom čítacom rámci ako reportérový gén. Hybridné proteíny, ktoré sú výsledkom expresie týchto rekombinantných génov, sa identifikujú použitím protilátok metódami enzýmového imunotestu. Hybridné gény, ktoré kombinujú vylučované proteíny a reportérové proteíny, umožňujú novým spôsobom skúmať mechanizmy sekrécie, ako aj lokalizáciu a pohyb secernovaných proteínov v tkanivách.
Hybridné toxíny
Séria prác I. Pastana a jeho spolupracovníkov o dizajne cielených hybridných toxínov dokonale ilustruje možnosti proteínového inžinierstva v zmysle kombinovania rôznych funkčných domén proteínov na dosiahnutie špecifických biologických účinkov.
Ryža. II.22. Cielené lieky na báze hybridných toxínov
a- zovšeobecnená schéma štruktúry lieku s riadeným účinkom; b– štruktúra pseudomonádového toxínu (čísla označujú polohu aminokyselinových zvyškov); v– štruktúra hybridného toxínu; G– hybridný toxín na báze monoklonálnych protilátok
Ideálny liek s prísne špecifickým selektívnym účinkom by mal vykazovať minimálne nasledujúce štrukturálne a funkčné vlastnosti (obr. II.22, a). Takéto liečivo musí obsahovať účinnú látku na dosiahnutie fyziologického účinku a ligand, ktorý rozpoznáva receptor na povrchu cieľových buniek. Okrem toho musí obsahovať štrukturálne prvky rozpoznávané telesným transportným systémom na dodávanie liečiva do cieľových buniek, ako aj medzerník potrebný na oddelenie účinnej látky od zostávajúcich funkčných častí liečiva po jeho doručení na adresu. Práve táto ideálna schéma je realizovaná v prirodzenom exotoxíne Pseudomonas aeruginosa. Exotoxín P. aeruginosa A je proteín pozostávajúci z jedného polypeptidového reťazca dlhého 613 aminokyselín, ktorý je organizovaný do troch funkčných domén (pozri obr. II.22, b). N-terminálna doména Ia (aminokyselinové zvyšky 1–252) je potrebná na interakciu s povrchom cieľových buniek (prototyp ligandu pre ideálne cielené liečivo). Funkcie domény Ib (aminokyselinové zvyšky 365–404) sú v súčasnosti neznáme. Doména II (aminokyselinové zvyšky 253-364) zabezpečuje účinný prenos toxínu do bunkového cytosólu (systém transportu liečiva) a doména III (aminokyselinové zvyšky 405-613) vykonáva ADP-ribozyláciu translačného elongačného faktora EF2, ktorý vedie k potlačeniu cieľov translácie a bunkovej smrti. Aby mal exotoxín A cytotoxický účinok, je teda potrebné rozpoznať receptory na bunkovom povrchu pomocou domény Ia, preniknúť do bunky pomocou receptorom sprostredkovanej endocytózy a translokovať sa cez vnútornú membránu do cytosólu, kde sa nachádza faktor EF2. je lokalizovaný. Hlavnou myšlienkou pri vytváraní cielených toxínov bolo nahradiť doménu Ia nejakým iným peptidovým ligandom, ktorý interaguje s inou skupinou receptorov na bunkovom povrchu, a tým zmeniť špecifickosť pôsobenia toxínu vo vzťahu k bunkám samotným (pozri obr. II. 22, v).
Zistilo sa, že odstránenie domény la metódami genetického inžinierstva dramaticky (stokrát a tisíckrát) znižuje toxicitu takéhoto skráteného proteínu ako vo vzťahu k bunkám rôznych línií, tak aj in vivo. Pripojenie k C-koncovej časti skráteného polypeptidu molekuly ľudského interleukínu 2 sa uskutočnilo kombináciou štruktúrnych častí zodpovedajúcich génov v expresnom vektore. Ukázalo sa, že purifikovaný hybridný toxín je extrémne toxický pre bunky nesúce na svojom povrchu receptory interleukínu 2 a nepôsobil na bunky, ktorým tieto receptory chýbali a ktoré odumreli pôsobením prirodzeného toxínu. Internalizácia(translokácia do buniek) hybridného toxínu bola sprostredkovaná podjednotkami p55 a p70 receptora interleukínu 2. V dôsledku pôsobenia hybridného toxínu na populáciu buniek, z ktorých niektoré exprimujú receptory interleukínu 2 na svojich povrchu, dochádza k selektívnej smrti týchto buniek.
Väčšina pokojových a pamäťových T buniek v tele neexprimuje na svojom povrchu vysokoafinitné receptory interleukínu 2, zatiaľ čo T bunky stimulované aloantigénmi takéto receptory obsahujú. Preto intraperitoneálne podávanie hybridného toxínu potkanom s experimentálnou artritídou, chorobou spôsobenou patologickou aktiváciou T-buniek, znížilo symptómy choroby. Hybridný toxín významne znížil odmietnutie transplantátu aj u myší.
Po týchto priekopníckych prácach nasledovala celá séria štúdií zameraných na vytvorenie podobných systémov na cielené podávanie rôznych cytotoxických polypeptidov. V procese ďalšieho zdokonaľovania systému cieleného podávania toxínu pseudomonas pomocou interleukínu 2 ako ligandu upustili od úplného odstránenia cieľovej domény toxínu a obmedzili ho na jej inaktiváciu zavedením štyroch miestne špecifických mutácií do toxínový gén. Molekuly tohto hybridného toxínu sa ukázali ako 10- až 100-krát účinnejšie cytotoxické látky proti ľudským a opičím bunkám exprimujúcim receptory pre interleukín 2 na svojom povrchu a mali tiež výrazne dlhší polčas v krvi myší in vivo v porovnaní s predtým získaný konštrukt.
Na základe pseudomonas toxínu boli vytvorené hybridné toxíny obsahujúce ako ligandy polypeptidové reťazce interleukínu 4, interleukínu 6, transformujúci rastový faktor typu a inzulínu podobný rastový faktor I. Preukázala sa vysoko špecifická cytotoxicita voči nádorovým bunkám (vrátane ľudských myelómových buniek). pre všetky tieto hybridné proteíny. ) so zodpovedajúcimi receptormi. Použitie v hybridnom toxíne ako ligandu časti CD4 polypeptidového reťazca, povrchového glykoproteínu T-buniek, ktorý je receptorom vírusu HIV a interaguje s jeho glykoproteínom gp120, umožnilo selektívne infikovať infikované T-bunky. s vírusom HIV a na svojom povrchu exprimujú vírusový proteín gp120.
Rovnaký princíp supresie infekcie spôsobenej vírusmi HIV rozpustnými CD4 receptormi bol použitý pri konštrukcii hybridných proteínov, ktoré kombinujú časti CD4 polypeptidových reťazcov s konštantnými časťami ťažkých alebo ľahkých reťazcov ľudských imunoglobulínov. Zároveň boli v procese kombinovania génov odstránené nukleotidové sekvencie kódujúce transmembránové a cytoplazmatické domény CD4, ako aj variabilná časť polypeptidových reťazcov imunoglobulínov. Výsledné hybridné molekuly, tzv imunoadhezínov, vďaka konštantnej časti molekuly imunoglobulínu získali v organizme zvýšenú stabilitu a navyše si zachovali špecifické vlastnosti sprostredkované konštantnými časťami imunoglobulínov: väzba Fc receptora a proteínu A, schopnosť fixovať komplement a prenášať cez placentárnu bariéru. Kombinácia všetkých týchto vlastností umožnila imunoadhezínom účinne prerušiť infekciu T-buniek vírusom HIV-I, blokujúc tak samotný vírus, ako aj bunky ním infikované, pričom na svojom povrchu exprimujú vírusový antigén gp120.
Ďalšie zlepšenie geneticky upravených konštruktov založených na Pseudomonas exotoxíne A nastalo po tom, čo sa ako cieľová časť hybridného toxínu začali používať variabilné domény monoklonálnych protilátok proti p55 zložke ľudského receptora interleukínu 2. V tomto rekombinantnom proteíne sa použil 15-mérový peptidový aminokyselinový linker na pripojenie variabilnej domény ťažkého reťazca tohto imunoglobulínu k variabilnej doméne jeho ľahkého reťazca a C-konca ľahkého reťazca k N-koncu. skráteného Pseudomonas toxínu (pozri obr. II.22, G). Takéto hybridné molekuly toxínu sa tiež ukázali ako vysoko špecifické cytotoxické činidlá proti ľudským leukemickým bunkám exprimujúcim receptory interleukínu 2 na svojom povrchu.
Vyvinutý prístup preukázal možnosť použitia špecifických protilátok ako cieľových častí hybridných toxínov. To poskytuje výskumníkom univerzálnu metódu cielenej dodávky toxínov, ktorá v budúcnosti umožní uplatniť cytotoxický účinok na akékoľvek skupiny buniek exprimujúce na svojom povrchu špecifické antigény, t.j. významne rozšírili počet cieľov pre chemoterapeutické účinky pomocou rekombinantných proteínov.
Okrem Pseudomonas exotoxínu A sa ako účinná látka v hybridných toxínoch úspešne použili difterický toxín, tumor nekrotizujúci faktor a reťazec ricínu A. Pretože A-proteín selektívne interaguje s konštantnými (Fc) časťami imunoglobulínov triedy G mnohých cicavcov, takýto hybridný toxín, spárovaný s imunoglobulínom pripraveným proti antigénu na bunkovom povrchu, sa selektívne viaže na tieto bunky a zabíja ich. Takéto imunotoxíny sú ďalším potenciálnym protinádorovým činidlom a možno ich použiť proti bunkám exprimujúcim špecifické antigény na svojom povrchu.
Ryža. II.23. Použitie fúzneho proteínu na reguláciu génovej expresie
Metódy genetického inžinierstva otvárajú nekonečné možnosti konštrukcie nových proteínov kombinovaním rôznych funkčných domén polypeptidových reťazcov v rôznych kombináciách. Produkcia cielených hybridných toxínov ilustruje možnosti takéhoto prístupu v proteínovom inžinierstve. Ako poslednú ilustráciu možností tejto skupiny metód uvažujme hybridný proteín ako nový regulátor aktivity génov. Pri konštrukcii takéhoto proteínu genetickým inžinierstvom bola doména viažuca DNA v receptore glukokortikoidného hormónu nahradená zodpovedajúcou doménou LexA represora E. coli (obr. II.23).
Zavedenie sekvencie génového operátora lexA do promótorovej oblasti globínového génu (alebo iných génov) viedla k aktivácii promótora pôsobením hybridného proteínu v prítomnosti dexametazónu, syntetického hormónu, ktorý interaguje s glukokortikoidným receptorom. V novom genetickom prostredí teda nukleotidová sekvencia génového operátora lexA E. coli fungovala ako transkripčný zosilňovač v prítomnosti fúzneho aktivačného proteínu rozpoznávajúceho túto sekvenciu. Výsledky práce demonštrujú možnosť vytvorenia nových proteínov - regulátorov aktivity génov spojením známych funkčných domén.
Rozvoj proteínového inžinierstva je do značnej miery obmedzený nedostatkom vedomostí o štruktúrnych a funkčných vzťahoch v proteínoch, čo je spôsobené zložitosťou predmetu štúdia. Početné práce zamerané na štúdium takýchto vzťahov majú spravidla empirický charakter a končia lokalizáciou aminokyselín nevyhnutných pre fungovanie aktívnych centier enzýmov. Preto hlavná úloha proteínového inžinierstva – získať proteín s požadovanými vlastnosťami zo známej sekvencie aminokyselinových zvyškov – nie je v súčasnosti ešte ani zďaleka vyriešená. Napriek tomu je niekedy možné cielene zmeniť niektoré vlastnosti existujúcich enzýmov nahradením malého počtu aminokyselinových zvyškov ich polypeptidových reťazcov pomocou miestne cielenej mutagenézy.
Dictionary Elution Elution je metóda extrakcie látky (vírusu) z pevného nosiča vymývaním Spôsob zobrazenia Metóda zobrazenia je metóda prezentácie heterológnych proteínov/peptidov na povrchu vírusov, buniek alebo bezbunkových kultúr na selekciu proteínov alebo peptidov s požadovanými vlastnosťami Biosensor Biosensor - analytický systém (biologický materiál + konvertor Elution Elution je metóda extrakcie látky (vírusu) z pevného nosiča jeho vymytím Display method Display method je metóda prezentácie heterológnych proteínov/peptidov na povrchu vírusov, buniek alebo bezbunkových vlastností Biosensor Biosensor je analytický systém (biologický materiál + prevodník), ktorý umožňuje detekciu látok v testovanej vzorke a odhad ich koncentrácií
Proteínové inžinierstvo 4 Súbor metód a prístupov na štúdium proteínov a získavanie proteínov s novými vlastnosťami HLAVNÉ CIELE Vytvoriť knižnicu nukleotidových a aminokyselinových sekvencií Skúmať účinky substitúcií jednotlivých aminokyselinových zvyškov na skladanie a funkciu proteínov Vyvinúť metódy efektívnej modifikácie proteínov dať im potrebné vlastnosti Vyvinúť metódy a prístupy na skríning a selekciu proteínov s požadovanými vlastnosťami
Racionálny dizajn Racionálny dizajn Potreba vedomostí o priestorovej organizácii proteínu Potreba vedomostí o intra- a intermolekulárnych interakciách Nedokonalé metódy a smerovanie zariadení zamerané na vytváranie nových proteínov de novo ich priestorovým dizajnom
Riadený vývoj molekúl proteínov smer zameraný na vytváranie nových proteínov prostredníctvom selekcie 1 získanie klonových knižníc náhodných aminokyselinových sekvencií 2 výber polypeptidových reťazcov, ktoré majú aspoň malý stupeň požadovaných vlastností 3 pomocou náhodnej mutagenézy získanie nových knižníc proteínových klonov, ktoré sa používajú v ďalšom kole selekcie alebo pomocou geneticky upravených konštruktov exprimujúcich nové proteíny
Riadená evolúcia proteínových molekúl (variantov) racionálny redizajn pomocou miestne riadenej mutagenézy nahrádza špecifické aminokyselinové zvyšky v aktívnom mieste enzýmového inžinierstva proteínových povrchov pomocou mutácií menia časti polypeptidového reťazca v blízkosti aminokyselinových zvyškov, ktoré sú blízko na povrchu proteínovej globule, ale umiestnené v značnej vzdialenosti v polypeptidovom reťazci od seba
Skríning a selekcia proteínov s požadovanými vlastnosťami náhodný skríning zlepšený skríningový výber každý proteín sa testuje na požadované vlastnosti; výber proteínov z knižnice je náhodný, každý proteín sa skúma na prítomnosť požadovaných vlastností; výber proteínov z knižnice je možný náhodne, ak sa objekty tvoriace knižnicu fenotypovo líšia (napríklad prítomnosťou enzymatickej aktivity) sú vytvorené podmienky na selektívne uchovanie komponentov knižnice, ktoré majú určité vlastnosti (fág, bunka display) sú vytvorené podmienky na selektívne uchovanie komponentov knižnice, ktoré majú určité vlastnosti (fág, bunkový display) detekcia proteínu s požadovanými vlastnosťami medzi veľkým počtom makromolekúl, ktoré tvoria výslednú klonovú knižnicu
Fágový displej Účel - exponovať cudzie proteíny na povrchu fágu Metóda bola vyvinutá v roku 1985 pre filamentózny bakteriofág M13. (gény pIII a pVIII sú vhodnými cieľovými miestami na inzerciu cudzieho fragmentu cDNA) Cieľom je exponovať cudzie proteíny na povrchu fága Metóda bola vyvinutá v roku 1985 pre vláknitý bakteriofág M13. (gény pIII a pVIII sú vhodné miesta na inzerciu cudzieho fragmentu cDNA) skonštruujte fúzny gén pozostávajúci z kódujúcich sekvencií cieľového proteínu a jedného z obalových proteínov fága s bakteriofágom infikujúcim E. coli počas zostavovania fágu sú začlenené fúzne proteíny do fágovej častice
Fagemid pomocný fág Fágový genóm Infekcia E. coli s knižnicou pomocných fágových plazmidov/fagemidom transformované bunky E. coli sa infikujú pomocným fágom, aby sa vytvorili fágové častice povrchovo exponované rôznymi variantmi cieľového proteínu plazmidovej knižnice/fagemidom transformovanej E. coli bunky , sú infikované pomocným fágom, aby sa získali fágové častice, na povrchu ktorých sú vystavené rôzne varianty cieľového proteínu
Perspektívy praktického využitia proteínového inžinierstva Medicína: *získať nové lieky; na vytvorenie diagnostických nástrojov a výrobu vakcín; *na štúdium mechanizmov imunitnej odpovede, ako aj chorôb imunitný systém Ekológia: *získať biokatalyzátory vo forme celých buniek s enzýmami imobilizovanými na ich povrchu; *získať biosenzory na účely diagnostiky a monitorovania životné prostredie; *na tvorbu bio adsorbentov za účelom odstraňovania toxických látok a iónov ťažkých kovov z prostredia
Meranie glukózy pomocou enzýmovej elektródy (schematické znázornenie experimentu L. Clarka). Oxidácia glukózy enzýmom glukózooxidáza za prítomnosti kyslíka: glukóza + O 2 H 2 O 2 + glukono-1,5-laktón. H 2 O 2 sa redukuje na platinovej elektróde pri potenciáli +700 mV; prúd tečúci v obvode je úmerný koncentrácii peroxidu vodíka (t.j. nepriamo glukózy).
Slovník Imobilizácia Imobilizácia je obmedzenie pohyblivosti molekúl a ich potvrdzovacie prestavby Aerotank Aerotank je systém čistenia odpadových vôd, nádrže, v ktorých sú WW, mikrobiálny kal a vzduch zmiešané čistenie vody, pôdy a atmosféry s využitím metabolického potenciálu biologických objektov - rastlín , huby, hmyz, červy a iné organizmy Imobilizácia Imobilizácia je obmedzenie pohyblivosti molekúl a ich potvrdenie prestavby a vzduchu Metánová nádrž Metánová nádrž je zásobník na biologické spracovanie organických polutantov pomocou baktérií v anaeróbnych podmienkach Bioremediácia Bioremediácia je súbor metód na úpravu vody, pôdy a atmosféry metabolický potenciál biologických objektov – rastlín, húb, hmyzu, červov a iných organizmov
Klasifikácia enzýmov Trieda Katalyzované reakcie Príklady enzýmov Oxidoreduktázy Redukčné a oxidačné reakcie Je známych viac ako 200 enzýmov. Kataláza, glukózooxidáza Transferázy Reverzibilný prenos skupín atómov z donorov na akceptory. Je známych viac ako 450 enzýmov. Pyruvátkináza, proteínkináza Hydrolázy Hydrolyzačné reakcie Je známych viac ako 200 hydroláz. Proteáza, amyláza, celuláza Lyázy Nehydrolytické odštiepenie skupín atómov zo substrátu za vzniku dvojitých väzieb Je známych viac ako 100 lyáz. Aspartáza, fumaráza Izomerázy Intramolekulárne prešmykové reakcie organických zlúčenín Je známych viac ako 50 enzýmov. Glukoseimerázové ligázy Vzájomné reakcie dvoch rôznych molekúl je známych viac ako 100. DNA ligáza, tryptofánsyntetáza
Mikroorganizmy Zdroje enzýmov Bacily sú biosyntetizátormi ribonukleáz, deoxyribonukleáz a proteáz, zatiaľ čo kvasinky sú biosyntetizátormi glukoamyláz, invertáz a rastlín kyslej fosfatázy Amylázy sa izolujú z jačmeňa, kyslá fosfatáza zo zemiakov, srdcová peroxidáza sa izoluje z chrenových zvierat Laktátová dehydrogenáza zvierat zo žalúdka sa izoluje alkalická fosfatáza . Na získanie pepsínu sa používa žalúdok ošípaných, zo srdca hovädzieho dobytka sa izoluje laktátdehydrogenáza a zo žalúdka alkalická fosfatáza. Prasací žalúdok sa používa na výrobu pepsínu
Metódy imobilizácie Fyzikálne metódy Chemické metódy adsorpcia na nerozpustný nosič, inklúzia v póroch gélu, priestorová separácia pomocou semipermeabilná membrána a ďalšie je založený na vytvorení nových kovalentných väzieb medzi enzýmom a nosičom
Výhodou imobilizovaných enzýmov je oddelenie enzýmov od reakčného média, zastavenie reakcie v správnom čase a získanie produktu, ktorý nie je kontaminovaný enzýmom; uskutočňovať proces v kontinuálnom režime a kontrolovať rýchlosť reakcie; meniť vlastnosti katalyzátora, jeho špecifickosť, závislosť od reakčných podmienok a citlivosť na denaturačné účinky; regulujú katalytickú aktivitu enzýmu pôsobením na nosič
Enzýmy v biotechnologickej výrobe Zdroj enzýmu, metóda imobilizácie Biotechnológia Acetyl neutraminát -9-fosfát syntáza Enzým E. coli. Zapracovanie do polyakrylamidového gélu. Syntéza sialových kyselín. Peroxidáza Enzým z chrenu. Kopolymerizácia a inkorporácia do alginátového gélu. Oxidácia fenolu v odpadových vodách. 3-ketosteroid dehydrogenáza Bunky Mycobacterium globiformis. Zapracovanie do polyakrylamidového gélu. Transformácia hydrokortizónu na prednizolón
Lavryashina M.B. KemSU Metódy ekologickej biotechnológie Biologické čistenie odpadových vôd Bio(fyto)sanácia Tvorba biologicky bezpečných insekticídov a herbicídov Tvorba biologicky bezpečných insekticídov a herbicídov Získavanie energie šetrnej k životnému prostrediu Vytváranie poľnohospodárskych rastlín odolných voči chorobám Bakteriálne vyplavovanie kovov Klonovanie ohrozených a vyhynutých druhov zvierat
Metódy čistenia odpadových vôd Mechanické (usadzovanie, filtrácia) Mechanické Chemické (vystavenie reagenciám) Chemické Fyzikálne chemické Biologické (biochemické samočistenie)) Biologické Najdôležitejším problémom biotechnológie je čistenie odpadových vôd
Aerotanky pracujú v kombinácii s ekvalizérom, usadzovacími nádržami, regenerátorom kalu a zhutňovačom kalu (lisom). aerotank aerotank
Metánová nádrž Metánová nádrž (z metánu a angl. nádrž - nádrž, cisterna) Skupiny baktérií Východiskové látky Produkty HYDROLYTICKÉ ACETOGÉNNE Organické polutanty Vyššie mastné kyseliny PRODUKCIA VODÍKA Vyššie mastné kyseliny H 2, CO 2, CH 3 COOH METÁN PRODUKÚCI H 2, CO 2, CH3COOH CH4, CO2
Fázy fermentácie metánu 1 biohydrolýza polyméru a acidogenéza (organické látky sa premieňajú na vyššie mastné kyseliny, acetát a vodík) 2 acetogenéza a dehydrogenéza (z vyšších mastných kyselín vzniká acetát a vodík) 3 Metanogenéza (vzniká metán, vodík a oxid uhličitý z acetát)
Fázujem. ROZVOJ CELULÓZY (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) PROTEOLITICKÝ PROTEOLIT (Clostridium, Petrococcus) Fáza II. ACETOGÉNNA (Syntrophobacter wolinii) fáza III. METANOGENERÁTORY (Metanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus vannielii) Príklady mikroorganizmov
BIOREMEDIÁCIA Metóda je založená na schopnosti mikroorganizmov využívať zložité organické látky a rozkladať ich na jednoduché „biologicky bezpečné“ látky Molekulárna biológia a genetika Ekológia Inžinierske vedy Mikrobiológia BIOREMEDIÁCIA
Bioremediácia. Prístupy. Využitie aktivity prirodzených „divokých“ mikroorganizmov Využitie aktivity prirodzených „divokých“ mikroorganizmov (potrebný je zosilňovač, napr. O 2) Použitie aktívnych kmeňov zavedených vo forme biologických produktov v miestach intenzívneho znečistenia
Štúdium biodiverzity kontaminovaných oblastí Izolácia mikroflóry schopnej ničiť odstránené škodliviny Aktivácia lokálnej mikroflóry (biostimulácia). Zavedenie špeciálnych mikroorganizmov-deštruktorov do kontaminovaných oblastí (bioremediácia) Bioremediácia. Etapy.
KONTAMINANTY Chemická analýza Inžinierske technológie Biostimulácia (Prírodné mikrobiálne spoločenstvá) Biostimulácia Bioremediácia (Umelé mikrobiálne biologické produkty) Bioremediácia Monitoring bioremediácie Biofytoremediácia (spoločenstvá rastlín a mikroorganizmov) Biofytoremediácia
Konštrukcia transgénnych rastlín odolných voči hmyzím škodcom 1. SYNTÉZA ŠPECIFICKÝCH TOXÍNOV 2. SYNTÉZA HYDROLYTICKÝCH ENZÝMOV OVPLYVŇUJÚCICH BUNEČNÉ STENY HMYZOV A INÝCH ŠKODKOV A PATOGÉNOV /CHITINÁZA, -1,3-PRYNTHEIS.GLUINÁZA PROINBITERY Inhibítory enzýmov, ktoré štiepia polysacharidy rastlín 4. Úprava sekundárneho metabolizmu rastlín na: a) obmedzenie potrebných látok b) syntézu nových repelentov a toxínov 5. Regulácia ochrannej reakcie: a) tkanivová expresia génov b ) regulácia génovej expresie rôznymi prírodnými a umelými faktormi zvýšená stabilita rastlín voči hubovému patogénu Phomopsis helianhi Zvýšená odolnosť transgénnych rastlín voči hubovému patogénu Phomopsis helianhi A B A - netransgénna rastlina B - transgénna rastlina A - netransgénna rastlina B - transgénna rastlina
Vzorový zoznam témy zahrnuté v teste na zápočet 1. História biotechnológií. Charakteristika historických období. Najvýznamnejšie objavy, ktoré zohrali dôležitú úlohu vo vývoji vedy. 2. Všeobecné pojmy biotechnológie: biotechnologický systém, biotechnologický proces, biotechnologický objekt. 3. Biotechnologické objekty, definícia, charakteristika miesta bioobjektu v biotechnologickom systéme, klasifikácia, príklady praktické uplatnenie. 4. Mikroorganizmy ako biologické objekty. Príklady, praktické využitie v biotechnológiách. 5. Bunkové a tkanivové kultúry ako biologické objekty. Príklady, praktické využitie v biotechnológiách. 6. Biotechnologický proces. Etapy. Stručný popis fáz biotechnologického procesu. 7. Charakteristika mikroorganizmov ako objektov selekcie. Selekcia mikroorganizmov v biotechnológiách. 8. Mutagenéza: definícia, formy mutagenézy, mutagénne faktory. 9. Selekcia mutantných mikroorganizmov vytvorených v procese selekcie v prípravnom štádiu biotechnologického procesu. 10. Selekcia biologických objektov. Etapy, prístupy, metódy.
11. Genetické inžinierstvo: účel, technika, biologické objekty, príklady praktickej aplikácie, moderné výdobytky. 12. Enzýmy genetického inžinierstva. Klasifikácia, charakteristika katalyzovaných reakcií. 13. Metódy získania génu v genetickom inžinierstve. Stručný popis, výhody a nevýhody metód. 14. Vektory v genetickom inžinierstve. Definícia, klasifikácia, požiadavky, stručný popis vektory. 15. Rekombinantná DNA. Definícia, účel, metódy získavania rekombinantnej DNA v genetickom inžinierstve. 16. Spôsoby zavedenia rekombinantnej DNA do recipientnej bunky a selekcie modifikovaných buniek v genetickom inžinierstve. 17. Transgenéza rastlín. Vektor. Základné stratégie. Spôsoby zavádzania transgénov a selekcie transgénnych organizmov. 18. Transgenéza zvierat. Vektor. Základné stratégie. Spôsoby zavádzania transgénov a selekcie transgénnych organizmov. 19. Bunkové inžinierstvo: účel, technika, biologické objekty, príklady praktickej aplikácie, moderné výdobytky. 20. Spôsoby kultivácie rastlinných buniek a tkanív. Podmienky kultivácie, klasifikácia a stručná charakteristika rastlinných kultúr v bunkovom inžinierstve
21. Somatické hybridy rastlín. Technika výroby, moderné výdobytky, príklady praktického použitia. 22. Protoplasty: definícia, využitie v bunkovom inžinierstve, metódy a podmienky izolácie protoplastov. 23. Kultivácia a fúzia protoplastov v bunkovom inžinierstve. Metódy, podmienky, fuzogény. 24. Praktické využitie bunkových kultúr a rastlinných pletív. Biosyntéza a biotransformácia, mikropropagácia, príklady transgénnych rastlín s cennými vlastnosťami. 25. Živočíšne bunkové inžinierstvo. Metódy, predmety, technika, moderné výdobytky, praktická aplikácia. 26. Bunkové a tkanivové kultúry zvierat. Klasifikácia plodín, podmienky pestovania, médiá, spôsoby získavania somatických hybridov, praktické využitie. 27. Kmeňové bunky. Charakteristický. Klasifikácia. Vyhliadky na uplatnenie. 28. Klonovanie. Charakteristika metódy. Klasifikácia. Vyhliadky na uplatnenie. 29. Biotechnologický proces. Kultivačná fáza. Hlavné štádiá, charakterizácia médií pre mikroorganizmy, rastlinné a živočíšne bunky. Vybavenie. 30. Biotechnologický proces. Kultivačná fáza. Spôsoby pestovania biologických objektov. Etapy rastu kultúry v bioreaktore, syntéza cieľového produktu.
31. Biotechnologický proces. Fáza získania produktu. Hlavné etapy a spôsoby separácie a čistenia biotechnologického produktu. Príklady biotechnologických produktov. 32. Ekologická biotechnológia: účel, metódy, biologické objekty, príklady praktického využitia, moderné výdobytky. 33. Ekologická biotechnológia. Problém pitná voda. Aeróbne metódy čistenia odpadových vôd. 34. Ekologická biotechnológia. Problém pitnej vody. Anaeróbne metódy čistenia odpadových vôd. 35. Ekologická biotechnológia. Bioremediácia, biofytoremediácia. 36. Biotechnológia: účel, predmet, úlohy, hlavné smery biotechnológie. Moderné výdobytky v oblasti biotechnológií. 37. Inžinierska enzymológia. Účel, problémy. Perspektívy. Zdroje enzýmov. 38. Imobilizované enzýmy. Výhody, spôsoby imobilizácie. 39. Imobilizované enzýmy. Nosiče na imobilizáciu, praktické využitie. 40. Proteínové inžinierstvo. Smery, metódy, vyhliadky.
