Vad är centrifugering i kemi. centrifugering

Presentation Beskrivning Centrifugering. Dess användning inom olika områden av biologi. med rutschkanor

Centrifugering. Dess användning inom olika områden av biologi. Kompletterad av: Levikov, D.A.

Centrifugering Detta är separationen av mekaniska blandningar i deras beståndsdelar genom inverkan av centrifugalkraft. Enheter som används för detta ändamål kallas centrifuger. Huvuddelen av centrifugen är en rötor med bon för centrifugrör monterade i den. Rotorn roterar med hög hastighet, som ett resultat av vilket betydande centrifugalkrafter skapas, under vilken mekaniska blandningar separeras, till exempel avsätts partiklar suspenderade i en vätska.

Processer som sker i en centrifug Följande processer är uppdelade i centrifuger: 1) Centrifugalfiltrering. 2) Centrifugal sedimentering. 3) Centrifugalförklaring.

Centrifugalfiltrering Centrifugalfiltrering är en process för att separera suspensioner i perforerade skålcentrifuger. Den inre ytan av en sådan trumma är täckt med en filterduk. Suspensionen kastas med centrifugalkraft till trummans väggar, medan den fasta fasen förblir på tygets yta, och vätskan passerar genom sedimentskiktet under inverkan av centrifugalkraften och tyget avlägsnas utåt genom hålen i trumman. Centrifugalfiltrering består vanligtvis av tre på varandra följande fysikaliska processer: 1) filtrering med bildning av sediment; 2) sedimentkomprimering; 3) avlägsnande från sedimentet av vätskan som hålls av molekylära krafter;

Centrifugalsedimentering Centrifugalsedimentering är processen att separera suspensioner i centrifuger med fat med solida väggar. Suspensionen införs i den nedre delen av trumman och kastas mot väggarna under inverkan av centrifugalkraften. Ett sedimentlager bildas vid väggarna och vätskan bildar ett inre lager och förskjuts från trumman genom att suspensionen kommer in i separationen. Samtidigt stiger vätskan upp, rinner över genom trummans kant och avlägsnas utanför. I detta fall äger två fysikaliska processer rum: 1) Avsättning av den fasta fasen. 2) Komprimering av sediment.

Centrifugalklarning Centrifugalklarning är en process för att separera fina suspensioner och kolloidala lösningar. Det utförs också i solida trummor. När det gäller fysisk väsen är centrifugalklarning en process för fri sedimentering av fasta partiklar inom området för centrifugalkrafter. I fat med solida väggar utförs även separation av emulsioner. Under inverkan av centrifugalkraften är emulsionens komponenter, i enlighet med densiteten, arrangerade i form av avgränsade skikt: det yttre skiktet av en vätska med högre densitet och det inre skiktet av en lättare vätska. Vätskor släpps ut från trumman separat.

I kliniska och sanitära laboratorier används centrifugering för att separera erytrocyter från blodplasma, blodproppar från serum, fasta partiklar från den flytande delen av urinen etc. För detta ändamål används antingen manuella centrifuger eller elektriska centrifuger, vars rotationshastighet kan justeras. Ultracentrifuger, vars rotorhastighet överstiger 40 000 rpm, används vanligtvis i experimentell praktik för att separera cellorganeller, separera kolloidala partiklar, makromolekyler och polymerer.

Centrifugeringsmetod inom cytologi Differentiell centrifugeringsmetod används för fraktionering av celler, dvs separering av deras innehåll i fraktioner beroende på den specifika vikten hos olika organeller och cellinneslutningar. För att göra detta roteras finmalda celler i en speciell apparat - en ultracentrifug. Som ett resultat av centrifugering faller cellkomponenter ut ur lösningen och ordnar sig i enlighet med deras densitet. Täta strukturer sedimenterar vid lägre centrifugeringshastigheter, medan mindre täta strukturer sedimenterar vid höga centrifugeringshastigheter. De resulterande skikten separeras och studeras separat.

Centrifugering inom växtbotanik och fysiologi Centrifugering gör det möjligt att erhålla olika fraktioner av subcellulära partiklar och att studera egenskaperna och funktionerna för varje fraktion separat. Till exempel kan kloroplaster isoleras från spenatblad, tvättas från cellfragment genom upprepad centrifugering i ett lämpligt medium, och deras beteende under olika experimentella förhållanden kan studeras, eller deras kemiska sammansättning kan bestämmas. Vidare är det möjligt, med användning av olika modifieringar av tekniken, att förstöra dessa plastider och isolera deras beståndsdelar med hjälp av differentiell centrifugering (upprepad sedimentering av partiklar vid olika accelerationsvärden). På så sätt kunde man visa att plastider innehåller strukturer som kännetecknas av en mycket ordnad struktur - den så kallade grana; all grana finns inom det kloroplastbegränsande membranet (kloroplasthöljet). Fördelarna med denna metod är helt enkelt ovärderliga, eftersom den tillåter en att avslöja förekomsten av funktionella subenheter som är en del av större subcellulära partiklar; i synnerhet, med hjälp av metoden för differentiell centrifugering, var det möjligt att visa att grana är det huvudsakliga strukturella elementet i kloroplasten.

Centrifugeringsmetod i virologi Bracke densitekan användas för både isolering och kvantitativ karakterisering av växtvirus. Som det visade sig är denna metod fylld med många möjligheter och används för närvarande i stor utsträckning inom virologi och molekylärbiologi. När man genomför studier genom centrifugering i en densitetsgradient, fylls ett centrifugrör delvis med en lösning, vars densitet minskar i riktning från botten till menisken. Sackaros används oftast för att skapa en gradient i fraktioneringen av växtvirus. Innan centrifugering påbörjas kan viruspartiklarna antingen fördelas genom lösningen eller appliceras på toppen av gradienten. Brakke föreslog tre olika tekniker för densitetsgradientcentrifugering. Vid isopepisk (jämvikts) centrifugering fortsätter processen tills alla partiklar i gradienten når en nivå där mediets densitet är lika med deras egen densitet. Således sker fraktionering av partiklar i detta fall enligt skillnader i deras densitet. Sackaroslösningar har inte tillräcklig densitet för isopycnal separation av många virus. Vid höghastighetszoncentrifugering appliceras viruset först på en tidigare skapad gradient. Partiklar av varje typ sedimenterar när de gör det genom en gradient i form av en zon, eller ett band, i en hastighet som beror på deras storlek, form och densitet. Centrifugeringen avslutas sedan när partiklarna fortfarande fortsätter att sedimentera. Jämviktszoncentrifugering liknar höghastighetszoncentrifugering, men i det här fallet fortsätter centrifugeringen tills ett isopyknalt tillstånd uppnås. Densitetsgradientens roll vid höghastighetscentrifugering är att förhindra konvektion och att fixera olika typer av molekyler i vissa zoner. Teorin bakom densitetsgradientcentrifugering är komplex och inte väl förstådd. I praktiken är detta en enkel och elegant metod som används flitigt när man arbetar med växtvirus.

Svårigheter att använda centrifugeringsmetoden Användningen av diär förknippad med många metodologiska svårigheter. För det första, när partiklar isoleras, kan deras struktur skadas. Därför var det nödvändigt att utveckla speciella metoder för celldestruktion som inte skulle orsaka skada på strukturen av subcellulära fraktioner. För det andra, eftersom subcellulära partiklar har membran, kan olika osmotiska effekter uppstå under deras frisättning. Följaktligen, för att ultrastrukturen av föremålen som studeras inte ska förstöras ens under deras isolering, är det nödvändigt att noggrant välja sammansättningen av mediet i vilket cellerna förstörs och partiklar fälls ut. Och slutligen kan tvättning av subcellulära partiklar (deras återsuspension i mediet och efterföljande centrifugering) leda till förlust av vissa ämnen som finns i dem, som går i lösning under inverkan av diffusionskrafter. I detta avseende är det ibland svårt att förstå vilka av de små molekylerna som verkligen är beståndsdelar i strukturerna som studeras, och vilka helt enkelt adsorberades av deras yta under isoleringsprocessen. Denna situation gör det svårt att exakt bestämma några av de funktionella egenskaperna hos utvalda objekt.

Centrifugering Detta är separationen av mekaniska blandningar i deras beståndsdelar.
genom inverkan av centrifugalkraften. Instrument som används för detta
mål kallas centrifuger.
Huvuddelen av centrifugen är en rotor med monterad i
den häckar för centrifugrör. Rotorn roterar med
hög hastighet, vilket resulterar i betydande
storleken på centrifugalkraften, under vilken inverkan
mekaniska blandningar separeras till exempel
sedimentering av partiklar suspenderade i vätska.

Processer som äger rum i en centrifug

Centrifuger delar följande processer:
1) Centrifugalfiltrering.
2) Centrifugal sedimentering.
3) Centrifugalförklaring.

centrifugalfiltrering

Centrifugalfiltrering är
processen att separera suspensioner i centrifuger med
perforerade trummor. Inre yta
av en sådan trumma täcks med en filterduk.
Suspensionen kastas av centrifugalkraft mot
trumväggar, medan den fasta fasen förblir på
vävnadsyta och vätskan under verkan
centrifugalkraften passerar genom sedimentskiktet och
tyget avlägsnas till utsidan genom hål i trumman.
Centrifugalfiltrering består vanligtvis av
tre på varandra följande fysiska processer:
1) filtrering med bildning av en fällning;
2) sedimentkomprimering;
3) avlägsnande från sedimentet av den kvarhållna vätskan
molekylära krafter;

centrifugal sedimentering

centrifugal sedimentering
Centrifugal sedimentering - separationsprocess
suspensioner i centrifuger med fat
solida väggar. Suspensionen injiceras i den nedre
del av trumman och under inverkan av centrifugalkraft
kastas mot väggarna. Väggarna bildar ett lager
sediment, och vätskan bildar det inre lagret och
förskjutits från trumman in i separationen
suspension. Vätskan stiger upp
häller över trummans kant och tas bort
ut.
I det här fallet äger två fysiska processer rum:
1) Avsättning av den fasta fasen.
2) Komprimering av sediment.

Centrifugalförklaring

Centrifugalförklaring - separationsprocess
tunna suspensioner och kolloidala lösningar. Så
detsamma utförs i solida fat.
Fysiskt, centrifugal
förtydligande är en process
fri avsättning av fasta partiklar i fält
centrifugalkrafter.
I fat med solida väggar
separationen av emulsioner utförs också. Under
verkan av centrifugalkraftkomponenter
emulsioner efter densitet
belägen i form av avgränsade lager:
det yttre lagret av en vätska med högre densitet
och ett inre lager av en lättare vätska.
Vätskor släpps ut från trumman separat.

I kliniska och sanitära laboratorier
centrifugeringsanvändning
att skilja erytrocyter från
blodplasma, blodproppar
serum, täta partiklar från
flytande del av urin etc. För
för detta ändamål, eller
manuella centrifuger, eller
elektriska centrifuger,
vars rotationshastighet
kan justeras.
Ultracentrifuger, hastighet
rotorernas rotation
överstiger 40 000 rpm,
används vanligtvis i
experimentell praktik
att separera organeller
celler, separation av kolloidal
partiklar, makromolekyler,
polymerer.

Användning av centrifugering inom parasitologi

Metoden används för att differentiera komplex
blodblandning, urin eller avföring, följt av
isolering av helminter från det för ytterligare
undersökning i mikroskop och fixering av materialet. PÅ
centrifugeringsprocess tillgänglig i provet
parasiter passerar genom filtret och samlas in
nedre koniska fack av röret. Filternät
med specialstora celler
i ett provrör är placerad vertikalt, som ett resultat
vad händer horisontellt (lateralt)
provfiltrering. Som ett resultat, grov
partiklar av osmält mat, fibrer deponeras i
blandningskammare och parasiterna och deras ägg
passera fritt genom filtret. Så
Således koncentreras parasiterna i
ytskikt av fint sediment, och
laboratorieläkaren kan bara noggrant välja
prov för mikroskopi med
automatisk pipett och applicera den på
glida.

Centrifugeringsmetod i cytologi

Differentiell metod
centrifugering används för
fraktionering av celler, dvs deras stratifiering
innehållet i bråkdelar beroende på det specifika
vikten av olika organeller och cellulära inneslutningar.
För att göra detta roteras finfördelade celler in
speciell apparat - ultracentrifug. PÅ
som ett resultat av centrifugering, cellkomponenter
fälls ut ur lösningen, sätter sig in
enligt dess densitet. Mer tät
strukturer avsätts med lägre hastigheter
centrifugering, och mindre tät - vid hög
hastigheter. De resulterande skikten separeras och studeras
separat.

10. Centrifugering i botanik och växtfysiologi

Centrifugering gör det möjligt att erhålla olika
fraktioner av subcellulära partiklar och utforska
egenskaper och funktioner för varje fraktion i
separat. Till exempel från spenatblad kan du
isolera kloroplaster, tvätta dem med
återcentrifugering på lämpligt sätt
medium från cellfragment och undersöka dem
beteende i olika experimentella
förhållanden eller bestämma deras kemiska sammansättning.
Vidare är det möjligt att tillämpa olika modifieringar
tekniker, förstör dessa plastider och isolera
genom
differentiell centrifugering (upprepade gånger
partikelavsättning vid olika värden
acceleration) deras beståndsdelar. Så
genom att man kunde visa att plastider innehåller
strukturer som är mycket ordnade
struktur, - de så kallade kornen; alla spannmål
är inne i den gränsande kloroplasten
membran (kloroplastens membran). Fördelar
denna metod är helt enkelt ovärderlig eftersom den
avslöjar existensen
funktionella underenheter som utgör
större subcellulära partiklar; särskilt,
använda metoden

11. Centrifugeringsmetod i virologi

Brakke densitetsgradient centrifugeringsmetoden kan vara
användas för både urval och förvärv
kvantitativa egenskaper hos växtvirus. Som det visade sig,
Denna metod är fylld med många möjligheter och är för närvarande
används i stor utsträckning inom området virologi och molekylär
biologi. När man bedriver forskning med metoden
densitetscentrifugeringscentrifugrör
delvis fylld med en lösning, vars densitet minskar
riktning från botten till menisken. För att skapa en gradient
fraktionering av växtvirus används oftast
sackaros. Innan centrifugering påbörjas kan viruspartiklarna
antingen fördelas över hela volymen av lösningen eller appliceras på
toppen av gradienten. Brakke föreslog tre olika metoder
densitetsgradientcentrifugering. Vid isopypisk
(jämvikts) centrifugeringsprocessen fortsätter tills
tills alla partiklar i gradienten når en nivå där densiteten
medium är lika med sin egen densitet. Således,
fraktionering av partiklar sker i detta fall i enlighet med
skillnader i deras densitet. Sackaroslösningar har inte
tillräcklig densitet för isopycnal separation av många
virus. Med höghastighets zoncentrifugering, viruset
tillämpas först på den tidigare skapade gradienten. Partiklar
av varje typ sediment samtidigt genom en gradient i form av en zon,
eller remsor, med en hastighet beroende på deras storlek, form och
densitet. Centrifugeringen avslutas när partiklarna
fortsätter att sedimentera. Jämvikt zonal
centrifugering liknande hastighet zonal
centrifugering, men i detta fall centrifugering

12. Svårigheter att använda centrifugeringsmetoden

Tillämpning av di
behäftad med många metodologiska svårigheter. Först kl
frigöring av partiklar kan skada deras struktur. Så
det var nödvändigt att utveckla speciella metoder för att förstöra celler,
som inte skulle orsaka skada på subcellulär struktur
fraktioner. För det andra, eftersom subcellulära partiklar har
membran, i processen att frigöras,
olika osmotiska effekter. Därför, för det
så att ultrastrukturen hos de föremål som studeras inte förstörs
även när de är isolerade är det nödvändigt att noggrant välja kompositionen
miljö där förstörelsen av celler och avsättningen
partiklar. Och slutligen, tvättning av subcellulära partiklar
(återsuspendera dem i mediet och sedan åter-
centrifugering) kan leda till förlust av vissa
ämnen som finns i dem, som under inverkan av diffusionskrafter
gå i lösning.
I detta avseende är det ibland svårt att förstå vilken av de små molekylerna
är verkligen delar av de strukturer som studeras, och vilka
adsorberades helt enkelt på ytan under isoleringsprocessen.
Denna situation gör det svårt att peka ut några
funktionella egenskaper för valda objekt.

Kursarbete

centrifugering

1. Metodprincip

Separationen av ämnen genom centrifugering baseras på partiklarnas olika beteende i ett centrifugalfält. Suspensionen av partiklar som placeras i ett provrör laddas i en rötor som är monterad på centrifugens drivaxel.

I ett centrifugalfält avsätts partiklar med olika densiteter, former eller storlekar i olika hastigheter. Sedimentationshastigheten beror påcentrifugalacceleration, direkt proportionell mot rotorns vinkelhastighet och avståndet mellan partikeln och rotationsaxeln:

och centrifugalaccelerationen blir då

Eftersom ett varv på rotorn är2p radianer, kan rotorns vinkelhastighet i varv per minut skrivas som:

Centrifugalacceleration uttrycks vanligtvis i enheterg och ringderelativ centrifugalacceleration , dvs.

eller

När du listar villkoren för att separera partiklar, ange rotationshastigheten och radien för rotorn, såväl som centrifugeringstiden. Centrifugalacceleration uttrycks vanligtvis i enheterg , beräknas från den genomsnittliga rotationsradien för vätskekolonnenicentrifugrör. Baserat på ekvationen sammanställde Dole och Kotzias ett nomogram som uttryckte GCC:s beroende av rotorhastigheten och radien r.

Ris. 2 .1. Nomogram för beräkning av centrifugalacceleration.

För att bestämma O är värdena på radien och rotorns rotationshastighet på de extrema skalorna anslutna med en rak linje; skärningspunkten för denna räta linje med medelskalan ger det önskade värdet på centrifugalaccelerationen. Man bör komma ihåg att den högra kolumnen av skalan nummer O motsvarar den högra kolumnen med siffror på rotorhastighetsskalan; vänster - vänster.

Sedimentationshastigheten för sfäriska partiklar beror inte bara på centrifugalacceleration, utan också på densiteten och radien för själva partiklarna och på suspensionsmediets viskositet. Den tid som krävs för sedimenteringen av en sfärisk partikel i ett flytande medium från den flytande menisken till botten av centrifugröret är omvänt proportionell mot sedimentationshastigheten och bestäms av följande ekvation:

vart - sedimenteringstid i sekunder,rj- mediets viskositet,Gh- partikelradie, rh- partikeldensitet, p - medeldensitet, gm- avstånd från rotationsaxeln till vätskans menisk, gd- avstånd från rotationsaxeln till botten av röret.

Som följer av ekvationen, vid en given rotorhastighet, är tiden som krävs för sedimenteringen av homogena sfäriska partiklar omvänt proportionell mot kvadraten av deras radier och skillnaden i partikel- och mediumdensiteter, och är direkt proportionell mot mediets viskositet . Därför kan en blandning av heterogena, ungefärligen sfäriska partiklar, som skiljer sig i densitet och storlek, separeras antingen på grund av olika tidpunkter för deras sedimentering till botten av röret vid en given acceleration, eller på grund av fördelningen av sedimenterande partiklar längs röret , som upprättas efter en viss tid. Vid separering av ämnen är det nödvändigt att ta hänsyn till sådana viktiga faktorer som mediets densitet och viskositet. De beskrivna metoderna kan separera cellorganeller från vävnadshomogenat. Huvudkomponenterna i en cell deponeras i följande sekvens: först hela celler och deras fragment, sedan kärnor, kloroplaster, mitokondrier, lysosomer, mikrosomer och slutligen ribosomer. Sedimenteringen av icke-sfäriska partiklar följer inte ekvationen, så partiklar med samma massa men olika former avsätts med olika hastigheter. Denna funktion används i studien med ultracentrifugering av konformationen av makromolekyler.

består i tilldelning av biologiskt material för efterföljande biokemiska studier. I detta fall kan stora mängder initialt biologiskt material tas, till exempel ympning av mikrobiella celler från satsvisa eller kontinuerliga odlingar, samt inokulering av växt- och djurceller från vävnads- och blodplasmakulturer. Med hjälp av preparativ centrifugering isoleras ett stort antal cellpartiklar för att studera deras morfologi, struktur och biologiska aktivitet. Metoden används också för att isolera sådana biologiska makromolekyler som DNA och proteiner från tidigare renade preparat.

Analytisk centrifugering Det används främst för att studera rena eller praktiskt taget rena preparat av makromolekyler eller partiklar, såsom ribosomer. I det här fallet används en liten mängd material, och sedimenteringen av de studerade partiklarna registreras kontinuerligt med speciella optiska system. Metoden gör det möjligt att erhålla data om materialets renhet, molekylvikt och struktur. I grundutbildningsverkstäder används preparativ centrifugering mycket oftare än analytisk centrifugering, så vi kommer att fokusera på det mer i detalj, även om båda metoderna är baserade på gemensamma principer.

2. Preparativ centrifugering

2 .1 Differentialcentrifugering

Denna metod är baserad på skillnader i sedimentationshastigheter för partiklar som skiljer sig från varandra i storlek och densitet. Materialet som ska separeras, till exempel ett vävnadshomogenat, centrifugeras med en stegvis ökning av centrifugalaccelerationen, vilken väljs så att i varje steg en viss fraktion avsätts på botten av röret. Vid slutet av varje steg separeras fällningen från supernatanten och tvättas flera gånger för att så småningom erhålla en ren utfälld fraktion. Tyvärr är det praktiskt taget omöjligt att få en absolut ren fällning; För att förstå varför detta händer, låt oss vända oss till processen som sker i centrifugröret i början av varje centrifugeringssteg.

För det första är alla partiklar i homogenatet jämnt fördelade över centrifugrörets volym, så det är omöjligt att få rena preparat av fällningarna av de tyngsta partiklarna i en centrifugeringscykel: den första fällningen som bildas innehåller huvudsakligen de tyngsta partiklarna, men, dessutom även en viss mängd av alla initiala komponenter. En tillräckligt ren beredning av tunga partiklar kan endast erhållas genom återsuspension och centrifugering av den initiala fällningen. Ytterligare centrifugering av supernatanten med en efterföljande ökning av centrifugalaccelerationen leder till sedimentering av partiklar av medelstorlek och densitet, och sedan till sedimentering av de minsta partiklarna med den lägsta densiteten. På fig. 2.3 är ett diagram över fraktionering av ett råttleverhomogenat.

Ris. 2.2. Differentiell centrifugering av en suspension av partiklar i ett centrifugalfält.

Först fördelas partiklarna jämnt över hela centrifugrörets volym. (a): under centrifugering sedimenterar partiklarna enligt deras storlek och form (b - e).

Ris. 2.3. Schema för fraktionering av råttleverhomogenat till subcellulära fraktioner.

Differentiell centrifugering verkar vara den vanligaste metoden för att isolera cellorganeller från vävnadshomogenat. Denna metod används mest framgångsrikt för att separera sådana cellorganeller som skiljer sig väsentligt från varandra i storlek och densitet. Men även i detta fall är de erhållna fraktionerna aldrig absolut homogena, och andra metoder används för ytterligare separation, som beskrivs nedan. Dessa metoder, baserade på skillnader i organelldensitet, ger effektivare separation genom centrifugering i lösningar med en kontinuerlig eller stegvis densitetsgradient. Nackdelen med dessa metoder är att det tar tid att erhålla lösningens densitetsgradient.

2.2 Zonhastighetscentrifugering

Zonhastighetsmetoden, eller, som den också kallas,s-zonal centrifugering, består i att testprovet skiktas på ytan av lösningen med en kontinuerlig densitetsgradient. Provet centrifugeras sedan tills partiklarna är fördelade längs gradienten i diskreta zoner eller band. Genom att skapa en densitetsgradient är det möjligt att undvika blandning av zoner till följd av konvektion. Den hastighetszonala centrifugeringsmetoden används för att separera RNA-DNA-hybrider, ribosomsubenheter och andra cellulära komponenter.

Ris. 2 .4. Hastighet och isopycnal separation av partiklar i en densitetsgradient. Innan centrifugeringen påbörjas skiktas partikelsuspensionen över vätskedensitetsgradienten (a). Med höghastighetscentrifugering når inte partiklar den isopycnala punkten, och med isopycnic separation fortsätter centrifugeringen tills partiklarna som studeras inte når zonen med motsvarande densitet. (b).

2.3 Isopycnic centrifugering

Isopyknisk centrifugering utförs både i en densitetsgradient och på vanligt sätt. Om centrifugeringen inte utförs i en densitetsgradient, centrifugeras preparatet först så att partiklar med en molekylvikt som är större än partiklarna som studeras sedimenterar. Dessa tunga partiklar kasseras och provet suspenderas i ett medium vars densitet är densamma som den för fraktionen som ska isoleras och centrifugeras sedan tills partiklarna som undersöks sedimenterar till botten av röret och partiklar med lägre densitet flyter till vätskans yta...

Ris. 2.5. Isopycnal separation utan densitetsgradient.

Före centrifugering är partiklarna jämnt fördelade över hela centrifugrörets volym (a). Efter centrifugering flyter lättare partiklar till toppen, medan tunga partiklar sedimenterar till botten av röret. (b)

Ett annat sätt är att skikta provet på ytan av lösningen med en kontinuerlig densitetsgradient som täcker intervallet av densiteter för alla komponenter i blandningen. Centrifugering utförs tills partiklarnas flyttäthet är lika med densiteten för motsvarande zoner, d.v.s. tills partiklarna separeras i zoner. Metoden kallas zonal-isopynic, eller resonanscentrifugering, eftersom huvudpoängen här är flyttätheten, och inte storleken eller formen på partiklarna. Mängden densitet vid vilken partiklar bildar isopycnala band påverkas av typen av suspensionsmediet; partiklar kan vara permeabla för vissa föreningar i lösning och ogenomträngliga för andra, eller så kan de fästa lösningsmolekyler. Vid användning av zonrotorn koncentreras mitokondrier, lysosomer, peroxisomer och mikrosomer i band med 42 %, 47 %, 47 % och 27 % sackaros, motsvarande en densitet på 1,18, 1,21, 1,21 och 1,10 g-cm-3 respektive. Tätheten hos subcellulära organeller beror också på deras selektiva upptag av vissa föreningar. Introduktion till råttor av det icke-hemolytiska tvättmedlet TritonWR-1339 leder till en ökning av storleken och en minskning av tätheten av leverlysosomer; tätheten av mitokondrier och peroxisomer förblir oförändrad. Trots det faktum att lysosomernas sedimenteringsegenskaper som regel inte förändras, minskar deras jämviktstäthet i sackarosgradienten från 1,21 till 1,1, vilket leder till en motsvarande separation av den lysosomala-peroxisomala fraktionen. Denna funktion används i den kvantitativa separationen av lysosomer, mitokondrier och peroxisomer, baserat på avlägsnandet från ett homogent medium av alla partiklar med en densitet som är större än mikrosomernas, och efterföljande isopycnal centrifugering av de utfällda tunga partiklarna.

2.4 Jämviktsdensitetsgradientcentrifugering

Tungmetallsalter, såsom rubidium eller cesium, samt sackaroslösningar används för att skapa en densitetsgradient. Ett prov, såsom DNA, blandas med en koncentrerad cesiumkloridlösning. Både det lösta ämnet och lösningsmedlet fördelas initialt jämnt över hela volymen. Under centrifugering etableras en jämviktsfördelning av koncentrationen och följaktligen densitetenCsCl, eftersom cesiumjoner har en stor massa. Under inverkan av centrifugalacceleration omfördelas DNA-molekyler och samlas i form av en separat zon i en del av provröret med en densitet som motsvarar dem. Metoden används främst vid analytisk centrifugering och användes av Meselson och Stahl för att studera mekanismen för DNA-replikation.E. coli . Jämviktär också en av metoderna för att separera och studera humana plasmalipoproteiner.

2. 5 Forma och extrahera gradienter

2.5.1 Gradienternas art

För att skapa densitetsgradienter av lösningar används oftast sackaroslösningar, ibland med ett fast pH. I vissa fall erhålls god separation vid användning i stället för vanligt vatten.D2 0. I tabellen. 2.1 visar egenskaperna hos vissa lösningar av sackaros.

Koncentration, %

Egenskaper för sackaroslösningar

Valet av gradienten dikteras av fraktioneringens specifika uppgifter. Så till exempel fikol, tillverkad av företagetPharmacia Bra Kemikalier, kan ersätta sackaros i de fall det är nödvändigt att skapa gradienter med hög densitet och lågt osmotiskt tryck. En annan fördel med ficol är att den inte passerar genom cellmembran. Tungmetallsalter, såsom rubidium och cesium, används för att skapa gradienter med högre densitet, dock på grund av den frätande effektenCsClsådana gradienter används endast i rotorer gjorda av resistenta metaller, såsom titan.

2.5.2 Stegdensitetsgradientteknik

För att skapa en densitetsgradient, införs flera lösningar med successivt minskande densitet försiktigt i ett centrifugrör med hjälp av en pipett. Därefter, på det översta skiktet, som har den lägsta densiteten, skiktas provet i form av en smal zon, varefter röret centrifugeras. Jämna linjära gradienter kan erhållas genom att jämna ut stegvisa gradienter under långvarig stående av lösningen. Processen kan påskyndas genom att försiktigt röra om innehållet i röret med en tråd eller genom att försiktigt skaka röret.

2.5.3 Teknik för att skapa en jämn densitetsgradient

I de flesta fall används en speciell enhet för att skapa en jämn densitetsgradient. Den består av två cylindriska kärl med strikt definierad identisk diameter, som kommunicerar med varandra i botten med ett glasrör med en kontrollventil, vilket gör att du kan justera proportionerna i vilka innehållet i båda kärlen blandas. En av dem är utrustad med en omrörare och har ett utlopp genom vilket lösningen strömmar in i centrifugrör. En tätare lösning placeras i en mixer; den andra cylindern är fylld med en lösning med lägre densitet. Höjden på kolumnen av lösningar i båda cylindrarna är inställd på ett sådant sätt att det hydrostatiska trycket i dem är detsamma. Den tätare lösningen töms gradvis från blandaren in i centrifugrören och ersätts samtidigt av en lika stor volym av lösningen med lägre densitet som kommer in i blandaren från den andra cylindern genom reglerventilen. Homogeniteten hos lösningen i blandaren säkerställs genom konstant blandning av lösningen med en omrörare. När lösningen dräneras i centrifugrör, minskar dess densitet och en linjär densitetsgradient skapas i rören. Icke-linjära gradienter kan skapas med ett system som består av två cylindrar med olika diameter.

För att bilda densitetsgradienter med olika branthet används ett system med två mekaniskt styrda sprutor, som är fyllda med lösningar med olika densitet. Olika gradienter kan skapas genom att ändra kolvarnas relativa hastighet.

2.5.4 Extraktion av gradienter från centrifugrör

Efter avslutad centrifugering och partiklarna separerats måste de bildade zonerna avlägsnas. Detta görs på flera sätt, oftast genom förskjutningsmetoden. Ett centrifugrör genomborras vid basen och ett mycket tätt medium, till exempel en 60-70 % sackaroslösning, införs långsamt i dess nedre del. Lösningen på toppen förskjuts och fraktioner tas med hjälp av en spruta, pipett eller speciell anordning ansluten genom ett rör till fraktionsuppsamlaren. Om rören är gjorda av celluloid eller nitrocellulosa, extraheras fraktionerna genom att skära av röret med ett speciellt blad. För att göra detta skärs ett centrifugrör fixerat i ett stativ direkt under den önskade zonen och fraktionen sugs av med en spruta eller pipett. Med en lämplig utformning av skäranordningen blir lösningsförlusten minimal. Uppsamlingen av fraktioner utförs också genom att sticka hål i provrörets bas med en tunn ihålig nål. Droppar som strömmar från röret genom nålen samlas upp i en fraktionsuppsamlare för vidare analys.

2.5.5 Preparativa centrifuger och deras tillämpningar

Preparativa centrifuger kan klassificeras i tre huvudgrupper: centrifuger för allmänna ändamål, höghastighetscentrifuger och preparativa ultracentrifuger.Generella centrifuger ge en maximal hastighet på 6000 rpm-1 och OCU upp till 6000g . De skiljer sig endast från varandra i kapacitet och har ett antal utbytbara rotorer: vinklade och med hängande glas. En av egenskaperna hos denna typ av centrifuger är deras stora kapacitet - från 4 till 6 dm3 , vilket gör att du inte bara kan ladda dem med 10,50 och 100 cm centrifugrör3 , men även fartyg med en kapacitet på upp till 1,25 dm3 . I alla centrifuger av denna typ är rotorerna stelt monterade på drivaxeln och centrifugrören måste tillsammans med deras innehåll vara noggrant balanserade och avvika i vikt med högst 0,25 g. bör placeras symmetriskt, ett mot andra, vilket säkerställer en jämn fördelning av provrören i förhållande till rotorns rotationsaxel.

Höghastighetscentrifuger ger en topphastighet på 25 000 rpm-1 och OCU upp till 89 000g. Rotorkammaren är utrustad med ett kylsystem som förhindrar uppvärmning som uppstår på grund av friktion under rotorns rotation. Höghastighetscentrifuger har som regel en kapacitet på 1,5 dm3 och är utrustade med utbytbara rotorer, både vinklade och med hängande glas.

Preparativa ultracentrifuger ge toppfart upp till 75 000 rpm-1 och maximal centrifugalacceleration 510 000g . De är utrustade med både ett kylskåp och en vakuumenhet för att förhindra överhettning av rotorn på grund av dess friktion med luften. Rotorerna i sådana centrifuger är gjorda av höghållfast aluminium eller titanlegeringar. Rotorer av aluminiumlegering används främst, men i de fall då särskilt höga varvtal krävs används titanrotorer. För att minska vibrationer till följd av rotorobalans på grund av ojämn fyllning av centrifugrör, har ultracentrifuger en flexibel axel. Centrifugerör och deras innehåll måste balanseras noggrant till en noggrannhet av 0,1 g. Liknande krav bör iakttas vid laddning av rotorer på centrifuger för allmänt bruk.

2.6 Utformning av rotorerna

2.6.1 Vinkelrotorer och rotorer med hängande skopor

Rotorerna för preparativa centrifuger är vanligtvis av två typer - vinklade och hängande skopor. De kallas vinklade eftersom centrifugrören som placeras i dem alltid har en viss vinkel mot rotationsaxeln. I rotorer med hängande glas är provrören installerade vertikalt, och när de roteras under verkan av den framväxande centrifugalkraften, rör de sig till ett horisontellt läge; lutningsvinkeln mot rotationsaxeln är 90°.

I vinkelrotorer är avståndet som partiklarna färdas till motsvarande vägg i provröret mycket litet, och därför sker sedimentering relativt snabbt. Efter att ha kolliderat med provrörets väggar glider partiklarna ner och bildar ett sediment i botten. Vid centrifugering uppstår konvektionsflöden, vilket i hög grad komplicerar separeringen av partiklar med liknande sedimenteringsegenskaper. Ändå används rotorer av liknande design framgångsrikt för att separera partiklar vars sedimentationshastigheter varierar ganska mycket.

I rotorer med hängande koppar observeras också konvektionsfenomen, men de är inte så uttalade. Konvektion är resultatet av det faktum att partiklarna under inverkan av centrifugalacceleration sätter sig i en riktning som inte är strikt vinkelrät mot rotationsaxeln, och därför träffar de, som i vinkelrotorer, provrörets väggar och glider till botten.

Konvektion och virveleffekter kan undvikas i viss utsträckning genom att använda sektoriellt formade rör i hängande kopparrotorer och genom att justera rotorhastigheten; som anges ovan, är metoden för centrifugering i en densitetsgradient också berövat nackdelarna.

2.6.2 Kontinuerliga rotorer

Kontinuerliga rotorer är designade för höghastighetsfraktionering av relativt små mängder fast material från suspensioner med stora volymer, till exempel för isolering av celler från näringsmedia. Under centrifugering tillsätts en suspension av partiklar till rotorn kontinuerligt; rotorns genomströmning beror på det avsatta preparatets karaktär och varierar från 100 cm3 upp till 1 dm3 på 1 min. Det speciella med rotorn är att det är en isolerad kammare med en speciell design; dess innehåll kommunicerar inte med den yttre miljön och är därför inte förorenad eller sprutad.

2.6.3 Zonal eller Anderson rotorer

Ris. 2 .6. Centrifugeringssteg (a- e) i zonrotorn

Zonalrotorer är gjorda av aluminium eller titanlegeringar, som kan motstå mycket betydande centrifugalaccelerationer. Vanligtvis har de ett cylindriskt hålrum, stängt med ett avtagbart lock. Inuti kaviteten, på rotationsaxeln, finns ett axiellt rör, på vilket ett munstycke med blad sätts på, som delar upp rotorkaviteten i fyra sektorer. Bladen eller bafflarna har radiella kanaler genom vilka en gradient injiceras från det axiella röret till rotorns periferi. Tack vare denna design av bladen reduceras konvektionen till ett minimum.

Fyllningen av rotorn utförs när den roterar med en hastighet av cirka 3000 rpm-1 . En förskapad gradient pumpas in i rotorn, utgående från ett lager med lägsta densitet, som är jämnt fördelat längs rotorns periferi och hålls vid dess yttre vägg vinkelrätt mot rotationsaxeln på grund av centrifugalkraften. Med efterföljande tillägg av gradientskikt med högre densitet sker en kontinuerlig förskjutning mot mitten av mindre täta skikt. Efter att hela gradienten har pumpats in i rotorn, fylls den till sin fulla volym med en lösning som kallas en "kudde", vars densitet är densamma som eller något överstiger den högsta densiteten för den förformade gradienten.

Sedan, genom det axiella röret, skiktas testprovet, som förskjuts från röret in i rotorns volym med hjälp av en lösning med lägre densitet, samtidigt tas samma volym av "kudden" bort från periferin. Efter alla dessa procedurer bringas rotorns rotationshastighet till arbetshastigheten och antingen zonhastighet eller zon-isopycnisk fraktionering utförs under den erforderliga tidsperioden.. Extraktion av fraktioner utförs vid en rotorhastighet av 3000 rpm-1 . Innehållet i rotorn förskjuts genom att lägga till en "kudde" från periferin, först och främst förskjuts mindre täta lager. På grund av den speciella utformningen av den axiella kanalen på Anderson-rotorn sker ingen blandning av zoner under deras förskjutning. Den utgående gradienten förs genom en registreringsanordning, till exempel en spektrofotometercell, med vilken proteinhalten kan bestämmas genom absorption vid 280 nm, eller genom en speciell radioaktivitetsdetektor, varefter fraktioner samlas upp.

Kapaciteten hos zonrotorer som används vid medelhastigheter varierar från 650 till 1600 cm3 , vilket gör att du kan få en ganska stor mängd material. Zonalrotorer används för att avlägsna proteinföroreningar från olika preparat och för att isolera och rena mitokondrier, lysosomer, polysomer och proteiner.

2.6.4 Analys av subcellulära fraktioner

Egenskaperna för beredningen av subcellulära partiklar erhållna genom fraktionering kan tillskrivas egenskaperna hos själva partiklarna endast om beredningen inte innehåller föroreningar. Därför är det alltid nödvändigt att utvärdera renheten hos de erhållna preparaten. Homogeniseringens effektivitet och närvaron av föroreningar i beredningen kan bestämmas genom mikroskopisk undersökning. Men frånvaron av synliga föroreningar är ännu inte ett tillförlitligt bevis på läkemedlets renhet. För att kvantifiera renheten hos det erhållna preparatet, utsätts det för kemisk analys, vilket gör att man kan bestämma innehållet av proteiner eller DNA i det, för att bestämma dess enzymatiska aktivitet, om möjligt, och immunologiska egenskaper.

Analys av distributionen av enzymer i fraktionerad vävnad bygger på två allmänna principer. Den första av dessa är att alla partiklar i en given subcellulär population innehåller samma uppsättning enzymer. Den andra antar att varje enzym är lokaliserat på någon specifik plats i cellen. Om denna position var sann skulle enzymerna kunna fungera som markörer för motsvarande organeller: till exempel skulle cytokromoxidas och monoaminoxidas fungera som mitokondriella markörenzymer, sura hydrolaser som lysosommarkörer, katalas som en peroxisommarkör och glukos-6- fosfatas - mikrosomal membranmarkör. Det visade sig dock att vissa enzymer, såsom malatdehydrogenas,R -glukuronidas, NADP' H-cytokrom-c-reduktas, är lokaliserade i mer än en fraktion. Därför bör valet av enzymmarkörer för subcellulära fraktioner i varje specifikt fall behandlas med stor försiktighet. Dessutom betyder frånvaron av ett markörenzym inte frånvaron av motsvarande organeller. Det är troligt att enzymet under fraktionering går förlorat av organellerna eller hämmas eller inaktiveras; därför bestäms vanligtvis minst två markörenzymer för varje fraktion.

Fraktion

2.7 Fraktionering genom differentiell centrifugering

2.7.1 Presentation av resultat

Resultaten från vävnadsfraktionering presenteras lämpligast i form av grafer. Sålunda, när man studerar fördelningen av enzymer i vävnader, är det bäst att presentera data i form av histogram, som gör det möjligt att visuellt utvärdera resultaten av experimenten.

Den enzymatiska aktiviteten av proteininnehållet i provet bestäms både i det ursprungliga homogenatet och i varje isolerad subcellulär fraktion separat. Den totala enzymatiska aktiviteten och proteinhalten i fraktionerna bör inte skilja sig signifikant från motsvarande värden i det ursprungliga homogenatet.

Därefter beräknas enzymatisk aktivitet och proteinhalt i varje fraktion i % av det totala utbytet, på basis av vilket ett histogram görs. Den relativa mängden protein i varje fraktion plottas sekventiellt längs abskissaxeln i ordningsföljd för deras isolering, och den relativa specifika aktiviteten för varje fraktion plottas längs ordinataaxeln. Således bestäms den enzymatiska aktiviteten för varje fraktion från stängernas yta.

2.7.2 Analytisk ultracentrifugering

Till skillnad från preparativ centrifugering, vars syfte är att separera ämnen och rena dem, används analytisk ultracentrifugering främst för att studera sedimenteringsegenskaperna hos biologiska makromolekyler och andra strukturer. Därför används rotorer och registreringssystem av en speciell design vid analytisk centrifugering: de låter dig kontinuerligt övervaka sedimenteringen av materialet.i centrifugalfält.

Analytiska ultracentrifuger kan nå hastigheter upp till 70 000 rpm -1 samtidigt som den skapar en centrifugalacceleration på upp till 500 000g . Deras rotor har som regel formen av en ellipsoid och är ansluten med hjälp av en sträng till motorn, vilket gör det möjligt att variera rotorns rotationshastighet. Rotorn roterar i en vakuumkammare utrustad med en kylanordning och har två celler, analytiska och balanserande, som är installerade i centrifugen strikt vertikalt, parallellt med rotationsaxeln. Balanseringscellen tjänar till att balansera den analytiska cellen och är ett metallblock med ett precisionssystem. Den har också två indexhål placerade på ett strikt definierat avstånd från rotationsaxeln, med hjälp av vilka motsvarande avstånd i den analytiska cellen bestäms. Analytisk cell, vanligtvis 1 cm 3 , har en sektoriell form. När den är korrekt installerad i rotorn, trots att den är upprätt, fungerar den på samma princip som en rotor med hängande skopor, vilket skapar nästan idealiska sedimenteringsförhållanden. I ändarna av den analytiska cellen finns fönster med kvartsglas. Analytiska ultracentrifuger är utrustade med optiska system som gör det möjligt att övervaka sedimenteringen av partiklar under hela centrifugeringsperioden. Med förutbestämda tidsintervall kan det sedimenterande materialet fotograferas. Vid fraktionering av proteiner och DNA övervakas sedimentationen genom absorption i ultraviolett ljus, och i de fall de studerade lösningarna har olika brytningsindex, med hjälp av ett schlieren-system eller ett Rayleigh-interferenssystem. De två sista metoderna bygger på att när ljus passerar genom en transparent lösning som består av zoner med olika densitet så bryts ljuset vid zongränsen. Vid sedimentering bildas en gräns mellan zonerna med tunga och lätta partiklar, som fungerar som en brytningslins; i detta fall visas en topp på den fotografiska plattan som används som detektor. Under sedimenteringen flyttas gränsen, och följaktligen toppen, vars rörelsehastighet kan användas för att bedöma materialets sedimentationshastighet. Interferometriska system är känsligare än schlierensystem. Analytiska celler är ensektor, som används oftast, och tvåsektor, som används för jämförande studie av lösningsmedlet och det lösta ämnet.

Inom biologi används analytisk ultracentrifugering för att bestämma molekylvikterna för makromolekyler, för att kontrollera renheten hos erhållna prover och för att studera konformationsförändringar i makromolekyler.

2.8 Tillämpning av analytisk ultracentrifugering

2.8.1 Bestämning av molekylvikter

Det finns tre huvudmetoder för att bestämma molekylvikter med hjälp av analytisk ultracentrifugering: bestämning av sedimentationshastighet, sedimentationsjämviktsmetod och sedimentationsjämviktsapproximationsmetod.

Bestämning av molekylvikt genom sedimentationshastighet - detta är den vanligaste metoden. Centrifugering utförs med höga hastigheter, så att partiklarna, initialt jämnt fördelade över hela volymen, börjar röra sig i ordning längs radien från rotationscentrum. Mellan området för lösningsmedlet, som redan är fritt från partiklar, och den del av det som innehåller dem, bildas ett tydligt gränssnitt. Denna gräns flyttas under centrifugering, vilket gör det möjligt att bestämma sedimentationshastigheten för partiklar med en av ovanstående metoder, och registrera denna rörelse på en fotografisk platta.

Sedimentationshastigheten bestäms av följande samband:

varX - avstånd från rotationsaxeln i cm,

t - tid i s,

w- vinkelhastighet i rad-s -1 ,

s - sedimentationskoefficient "molekyler.

Sedimentationskoefficienten är hastigheten per accelerationsenhet, den mäts iSeedberg-enheter ; 1 swedberg enhet är lika med 10 _13 med. Numeriskt värdesberor på partiklarnas molekylvikt och form och är ett värde som är karakteristiskt för en given molekyl eller supramolekylär struktur. Till exempel är sedimentationskoefficienten för lysozym 2,15S; katal aza har en sedimentationsfaktor på 11,35S, underenheter av bakteriella ribosomer - från 30 till 50Soch subenheter av eukaryota ribosomer - från 40 till 60S.

varM är molekylens molekylvikt,R är gaskonstanten,T är den absoluta temperaturen,sär sedimentationskoefficienten för molekylen,D är diffusionskoefficienten för molekylen,v - partiell specifik volym, som kan betraktas som den volym som upptas av ett gram av ett löst ämne, p - lösningsmedlets densitet.

Metod för sedimentationsbalans. Bestämningen av molekylvikter med denna metod utförs vid relativt låga rotorhastigheter, i storleksordningen 7 000-8 000 rpm -1 så att molekyler med stor molekylvikt inte sätter sig till botten. Ultracentrifugering utförs tills partiklarna når jämvikt, som å ena sidan etableras under inverkan av centrifugalkrafter, och diffusionskrafter, å andra sidan, det vill säga tills partiklarna slutar röra sig. Sedan, enligt den resulterande koncentrationsgradienten, beräknas ämnets molekylvikt enligt formeln

varR är gaskonstanten,T - absolut temperatur, o - vinkelhastighet, p - lösningsmedlets densitet,v - partiell specifik volym,med X ochmed 2 är koncentrationen av ett löst ämne över avståndG G och g 2 från rotationsaxeln.

Nackdelen med denna metod är att det tar lång tid att uppnå sedimentationsjämvikt - från flera dagar till flera veckor med kontinuerlig drift av centrifugen.

Metoden för att närma sig sedimentationsjämvikt var utvecklats för att bli av med nackdelarna med den tidigare metoden förknippade med en stor investering av tid som krävs för att "utjämnas". Med denna metod är det möjligt att bestämma molekylvikter när den centrifugerade lösningen är i ett tillstånd av approximation till jämvikt. För det första är makromolekylerna jämnt fördelade över hela volymen av den analytiska cellen; sedan, allteftersom centrifugeringen fortskrider, sedimenterar molekylerna, och densiteten av lösningen i meniskområdet minskar gradvis. Förändringen i densitet registreras noggrant, och sedan, genom komplexa beräkningar som involverar ett stort antal variabler, bestäms molekylvikten för en given förening av formlerna:

varR är gaskonstanten,T är den absoluta temperaturen,v - partiell specifik volym, p - lösningsmedelsdensitet,dcldr -nt, g moch g d- avstånd till menisken respektive botten av röret, s moch med d- koncentration av makromolekyler vid menisken respektive i botten av röret,M m ochM R -värden av molekylvikter, bestämt av fördelningen av koncentrationen av ämnet vid menisken respektive botten av provröret.

2.8.2 Utvärdering av preparatens renhet

Analytisk ultracentrifugering används i stor utsträckning för att bedöma renheten hos DNA-, virus- och proteinberedningar. Renheten hos preparat är utan tvekan mycket viktig i fall där det krävs för att noggrant bestämma molekylvikten för molekylen. I de flesta fall kan preparatets homogenitet bedömas utifrån sedimentationsgränsens karaktär med sedimentationshastighetsmetoden: ett homogent preparat ger vanligtvis en skarpt definierad gräns. Föroreningar som finns i preparatet visas som en ytterligare topp eller skuldra; de bestämmer också asymmetrin hos huvudtoppen.

2.8.3 Studie av konformationsförändringar i makromolekyler

Ett annat tillämpningsområde för analytisk ultracentrifugering är studiet av konformationsförändringar i makromolekyler. DNA-molekylen kan till exempel vara enkel- eller dubbelsträngad, linjär eller cirkulär. Under påverkan av olika föreningar eller vid förhöjda temperaturer genomgår DNA ett antal reversibla och irreversibla konformationsförändringar, som kan bestämmas genom att ändra provets sedimentationshastighet. Ju mer kompakt molekylen är, desto lägre friktionskoefficient i lösning och vice versa: ju mindre kompakt den är, desto högre friktionskoefficient och följaktligen desto långsammare kommer den att sedimentera. Således gör skillnader i sedimentationshastigheten för ett prov före och efter olika effekter på det det möjligt att detektera konformationsförändringar som inträffar i makromolekyler.

I allosteriska proteiner, såsom till exempel aspartattranskarbamoylas, sker konformationsförändringar som ett resultat av deras bindning till ett substrat och små ligander. Dissociationen av ett protein till subenheter kan induceras genom att behandla det med substanser som urea eller paraklorkvicksilverbensoat. Alla dessa förändringar kan enkelt övervakas med analytisk ultracentrifugering.

Centrifugering är separationen av mekaniska blandningar i deras beståndsdelar genom inverkan av centrifugalkraft. Enheter som används för detta ändamål kallas centrifuger. Huvuddelen av centrifugen är en rötor med bon för centrifugrör monterade i den. Rotorn roterar med hög hastighet, som ett resultat av vilket betydande centrifugalkrafter skapas, under vilken mekaniska blandningar separeras, till exempel avsätts partiklar suspenderade i en vätska.

Centrifuger: 1 - manuell: 2 - med elektrisk drivning.

I kliniska och sanitära laboratorier används centrifugering för att separera från blodplasma, från täta partiklar från den flytande delen av urinen etc. För detta ändamål används antingen manuella centrifuger (fig. 1) eller elektriska centrifuger, rotationshastigheten på som kan justeras (fig. 2).

Ultracentrifuger, vars rotorhastighet överstiger 40 000 rpm, används vanligtvis i experimentell praktik för att separera cellorganeller, separera kolloidala partiklar, makromolekyler, etc.

Centrifugering är separationen av grova system, bestående av flytande och fasta komponenter med olika densiteter, med hjälp av speciella apparater som kallas centrifuger. Principen för driften av centrifugen är baserad på skapandet av en stor centrifugalkraft, under påverkan av vilken separeringshastigheten för komponenterna i blandningen som placeras i centrifugen ökar många gånger jämfört med hastigheten för deras separation under verkan av gravitationen.

Centrifugeringsmetoden används ofta inom biologi, medicin och teknik, och ersätter ofta processerna för filtrering, sedimentering och tryckning.

Centrifugen har ett hus, en drivmekanism, en rötor, en arbetskammare (omslutande) och en kontrollpanel. Vissa centrifuger är utrustade med en elektrisk klocka som ger automatisk avstängning och bromsning i intervallet från 5 till 60 minuter. Specialcentrifuger har kyl- och vakuumenheter med spårnings- och automatiska styrenheter. Huvuddelen av varje centrifug är rotorn (i laboratoriecentrifuger är den vanligtvis placerad på en vertikalt monterad elmotoraxel eller roteras av olika växlar från motoraxeln, ibland till och med manuellt). Centrifugerotorn är en skiva (kors) med gångjärnshylsor för metallhylsor, i vilka provrör placeras, som under rotation intar horisontellt läge.

Ibland är rotorn gjord i form av en solid metall stympad kon med celler för provrör (vinkelrotor); rören i den är placerade i en konstant vinkel mot rotationsaxeln (vanligtvis 40°). Med provrörens lutande läge separeras komponenterna i blandningen snabbare. Separering av blandningen utförs i provrör av olika former och volymer (Fig. 1). När man arbetar i höga hastigheter används provrör av polyeten, eftersom glaset spricker. Provrören med det bearbetade materialet placerat mot varandra i rotorn måste balanseras. Detta ger en jämn belastning på rotoraxeln och säkerställer en jämn rotation av centrifugaxeln. För att balansera provrören används speciella vågar (fig. 2).

Ris. 1. Rör för centrifugering.

Ris. 2. Centrifugera vågar.

Centrifuger som används inom industrin skiljer sig från laboratoriecentrifuger i en mer komplex rotorkonstruktion, vilket gör det möjligt att centrifugera en stor mängd material samtidigt eller att genomföra separationsprocesser kontinuerligt.

Centrifuger med låg rotorhastighet används inom medicin för att separera urinsediment, blodserum från blodproppar, erytrocytsedimentering, i serologiska studier etc.

Mikrocentrifugen (fig. 4) manövreras manuellt; utrustad med två utbytbara munstycken, varav ett har bon för mikrorör och används för att bestämma blodets kompatibilitet; den andra - med ett uttag för att sätta in en graderad mikropipett (hematokrit) - är avsedd att bestämma andelen blodkroppar.

Ris. 3. Manuell centrifug.

Ris. 4. Mikrocentrifug.

Den manuella centrifugen (fig. 3) har fyra metall- eller plasthylsor för 15 ml rör.

Klinisk laboratoriecentrifug TsLK-1 (fig. 5, 7) har tre rotationshastigheter (1000, 1500, 3000 rpm). Korsrotorn är anpassad för 12 konventionella centrifugrör. Den största volymen centrifugerad vätska är 150 ml.

Centrifuger med hög rotorhastighet är i de flesta fall utrustade med utbytbara rotorer avsedda för olika vätskevolymer och används för att separera fina suspensioner.

Laboratoriecentrifugen TsLN-2 (fig. 5, 2) har en vinklad rötor för sex korta provrör med en total kapacitet på 72 ml. Maximal rotationshastighet -9000 rpm.

Ris. 5. Olika laboratoriecentrifuger: 1 - kliniska; 2 - skrivbord; 3 - hörn litet; 4 - stationär; 5 - kylskåp.

Liten vinkelcentrifug TsUM-1 (Fig. 5, 3) har tre utbytbara vinkelrotorer med olika antal provrör och hematokrit: en rotor för 6 provrör med en total kapacitet på 150 ml, en rotor för 10 provrör med totalt kapacitet på 120 ml, en rötor för 24 provrör med en total kapacitet på 120 ml, hematokrit för två kapillärer. Den maximala rotationshastigheten är 10 000 rpm.

Centrifugen är utrustad med en elektrisk klockmekanism.

Stationär laboratoriecentrifug TsLS-2 (Fig. 5, 4) har två utbytbara rotorer. Tvärrotorn är utrustad med fyra stålhylsor med en kapacitet på 500 ml och fyra provrör i glas för dem med en kapacitet på 250 ml. Vinkelrotorn levereras med 8 polyeten- och stålprovrör med en kapacitet på 50-75 ml. Rotorernas maximala rotation är upp till 6000 rpm. Centrifugen är utrustad med en elektrisk klockmekanism.

Bland specialcentrifugerna finns den kylda laboratoriecentrifugen CLR-1 (Fig. 5.5), avsedd för centrifugering vid låga temperaturer (-5 ° och över) av olika ämnen som förändras även vid rumstemperatur - mestadels proteinsuspensioner. Centrifugen har tre utbytbara rotorer som ger olika centrifugeringslägen. Två rotorer är identiska med de tekniska egenskaperna hos centrifugrotorerna av typen TsLS-2, den tredje rotorn, som sätts på en extra axel, utvecklar 18 000-18 500 rpm. Den maximala volymen av studieläkemedlet är 48 ml. Centrifugen är utrustad med en elektrisk klockmekanism. Kylning av arbetskammaren utförs med hjälp av en kylmaskin.

Se även Ultracentrifugering.

Kursarbete

centrifugering

1. Metodens princip

I ett centrifugalfält avsätts partiklar med olika densiteter, former eller storlekar i olika hastigheter. Sedimentationshastigheten beror på centrifugalaccelerationen, som är direkt proportionell mot rotorns vinkelhastighet och avståndet mellan partikeln och rotationsaxeln:

och centrifugalaccelerationen blir då

Eftersom ett varv av rotorn är 2n radianer, kan rotorns vinkelhastighet i varv per minut skrivas som:

Centrifugalacceleration uttrycks vanligtvis i enheter av g och kallas relativ centrifugalacceleration, d.v.s.

När du listar villkoren för att separera partiklar, ange rotationshastigheten och radien för rotorn, såväl som centrifugeringstiden. Centrifugalacceleration uttrycks vanligtvis i enheter av g, beräknat från den genomsnittliga rotationsradien för en vätskekolonn i ett centrifugrör. Baserat på ekvationen sammanställde Dole och Kotzias ett nomogram som uttryckte GCC:s beroende av rotorhastigheten och radien r.

där t är sedimenteringstiden i sekunder, rj är mediets viskositet, rh är partikelns radie, rf är partikelns densitet, p är mediets densitet, hm är avståndet från rotationsaxeln till vätskans menisk, där är avståndet från rotationsaxeln till botten av provröret.

Preparativ centrifugering består i att isolera biologiskt material för efterföljande biokemiska studier. I detta fall kan stora mängder initialt biologiskt material tas, till exempel ympning av mikrobiella celler från satsvisa eller kontinuerliga odlingar, samt inokulering av växt- och djurceller från vävnads- och blodplasmakulturer. Med hjälp av preparativ centrifugering isoleras ett stort antal cellpartiklar för att studera deras morfologi, struktur och biologiska aktivitet. Metoden används också för att isolera sådana biologiska makromolekyler som DNA och proteiner från tidigare renade preparat.

Analytisk centrifugering används främst för att studera rena eller väsentligen rena preparat av makromolekyler eller partiklar, såsom ribosomer. I det här fallet används en liten mängd material, och sedimenteringen av de studerade partiklarna registreras kontinuerligt med speciella optiska system. Metoden gör det möjligt att erhålla data om materialets renhet, molekylvikt och struktur. I grundutbildningsverkstäder används preparativ centrifugering mycket oftare än analytisk centrifugering, så vi kommer att fokusera på det mer i detalj, även om båda metoderna är baserade på gemensamma principer.

2. Preparativ centrifugering

2.1 Differentialcentrifugering

2.2 Hastighetszoncentrifugering

Metoden för zonal-speed, eller, som den också kallas, s-zonal centrifugering, består i att skikta testprovet på ytan av en lösning med en kontinuerlig densitetsgradient. Provet centrifugeras sedan tills partiklarna är fördelade längs gradienten i diskreta zoner eller band. Genom att skapa en densitetsgradient är det möjligt att undvika blandning av zoner till följd av konvektion. Den hastighetszonala centrifugeringsmetoden används för att separera RNA-DNA-hybrider, ribosomsubenheter och andra cellulära komponenter.

2.3 Isopycnic centrifugering

Ett annat sätt är att skikta provet på ytan av lösningen med en kontinuerlig densitetsgradient som täcker intervallet av densiteter för alla komponenter i blandningen. Centrifugering utförs tills partiklarnas flyttäthet är lika med densiteten för motsvarande zoner, d.v.s. tills partiklarna separeras i zoner. Metoden kallas zonal-isopynic, eller resonanscentrifugering, eftersom huvudpoängen här är flyttätheten, och inte storleken eller formen på partiklarna. Mängden densitet vid vilken partiklar bildar isopycnala band påverkas av typen av suspensionsmediet; partiklar kan vara permeabla för vissa föreningar i lösning och ogenomträngliga för andra, eller så kan de fästa lösningsmolekyler. Vid användning av zonrotorn koncentreras mitokondrier, lysosomer, peroxisomer och mikrosomer i band med 42 %, 47 %, 47 % och 27 % sackaros, motsvarande en densitet på 1,18, 1,21, 1,21 respektive 1,10 g-cm -3. Tätheten hos subcellulära organeller beror också på deras selektiva upptag av vissa föreningar. Introduktion till råttor av tvättmedlet Triton WR-1339, som inte orsakar hemolys, leder till en ökning av storleken och en minskning av tätheten av leverlysosomer; tätheten av mitokondrier och peroxisomer förblir oförändrad. Trots det faktum att lysosomernas sedimenteringsegenskaper som regel inte förändras, minskar deras jämviktstäthet i sackarosgradienten från 1,21 till 1,1, vilket leder till en motsvarande separation av den lysosomala-peroxisomala fraktionen. Denna funktion används i den kvantitativa separationen av lysosomer, mitokondrier och peroxisomer, baserat på avlägsnandet från ett homogent medium av alla partiklar med en densitet som är större än mikrosomernas, och efterföljande isopycnal centrifugering av de utfällda tunga partiklarna.

2.4 Jämviktsdensitetsgradientcentrifugering

Tungmetallsalter, såsom rubidium eller cesium, samt sackaroslösningar används för att skapa en densitetsgradient. Ett prov, såsom DNA, blandas med en koncentrerad cesiumkloridlösning. Både det lösta ämnet och lösningsmedlet fördelas initialt jämnt över hela volymen. Under centrifugering etableras en jämviktsfördelning av koncentrationen och följaktligen densiteten av CsCl, eftersom cesiumjoner har en stor massa. Under inverkan av centrifugalacceleration omfördelas DNA-molekyler och samlas i form av en separat zon i en del av provröret med en densitet som motsvarar dem. Metoden används främst vid analytisk centrifugering och användes av Meselson och Stahl för att studera mekanismen för E. coli DNA-replikation. Jämviktär också en av metoderna för att separera och studera humana plasmalipoproteiner.

2.5Forma och extrahera gradienter

2.5.1 Gradienternas art

För att skapa densitetsgradienter av lösningar används oftast sackaroslösningar, ibland med ett fast pH. I vissa fall får man en bra separation genom att använda D2 0 istället för vanligt vatten. 2.1 visar egenskaperna hos vissa lösningar av sackaros.

Valet av gradienten dikteras av fraktioneringens specifika uppgifter. Till exempel kan ficol, tillverkat av Pharmacia FineChemicals, ersätta sackaros i de fall det är nödvändigt att skapa gradienter med hög densitet och lågt osmotiskt tryck. En annan fördel med ficol är att den inte passerar genom cellmembran. Tungmetallsalter, såsom rubidium och cesium, används för att skapa gradienter med högre densitet, men på grund av den korrosiva effekten av CsCl används sådana gradienter endast i rotorer gjorda av resistenta metaller, såsom titan.

2.5.2 Stegdensitetsgradientteknik

2.5.3 Teknik för att skapa en jämn densitetsgradient

2.5.4 Extraktion av gradienter från centrifugrör

2.5.5 Preparativa centrifuger och deras tillämpningar

Preparativa centrifuger kan klassificeras i tre huvudgrupper: centrifuger för allmänna ändamål, höghastighetscentrifuger och preparativa ultracentrifuger. Generella centrifuger ger en maximal hastighet på 6000 rpm och RCF upp till 6000 g. De skiljer sig endast från varandra i kapacitet och har ett antal utbytbara rotorer: vinklade och med hängande glas. En av egenskaperna hos denna typ av centrifuger är deras stora kapacitet - från 4 till 6 dm3, vilket gör att de kan laddas inte bara med centrifugrör på 10,50 och 100 cm3, utan också med kärl med en kapacitet på upp till 1,25 dm3. I alla centrifuger av denna typ är rotorerna stelt monterade på drivaxeln och centrifugrören måste tillsammans med deras innehåll vara noggrant balanserade och avvika i vikt med högst 0,25 g. bör placeras symmetriskt, ett mot andra, vilket säkerställer en jämn fördelning av provrören i förhållande till rotorns rotationsaxel.

Höghastighetscentrifuger ger en topphastighet på 25 000 rpm-1 och en RCF på upp till 89 000 g. Rotorkammaren är utrustad med ett kylsystem som förhindrar uppvärmning som uppstår på grund av friktion under rotorns rotation. Höghastighetscentrifuger har som regel en kapacitet på 1,5 dm3 och är utrustade med utbytbara rotorer, både vinklade och hängande skopor.

Preparativa ultracentrifuger ger en topphastighet på upp till 75 000 rpm och en maximal centrifugalacceleration på 510 000 g. De är utrustade med både ett kylskåp och en vakuumenhet för att förhindra överhettning av rotorn på grund av dess friktion med luften. Rotorerna i sådana centrifuger är gjorda av höghållfast aluminium eller titanlegeringar. Rotorer av aluminiumlegering används främst, men i de fall då särskilt höga varvtal krävs används titanrotorer. För att minska vibrationer till följd av rotorobalans på grund av ojämn fyllning av centrifugrör, har ultracentrifuger en flexibel axel. Centrifugerör och deras innehåll måste balanseras noggrant till en noggrannhet av 0,1 g. Liknande krav bör iakttas vid laddning av rotorer på centrifuger för allmänt bruk.

2.6 Utformning av rotorerna

2.6.1 Vinkelrotorer och rotorer med hängande skopor

2.6.2 Kontinuerliga rotorer

Kontinuerliga rotorer är designade för höghastighetsfraktionering av relativt små mängder fast material från suspensioner med stora volymer, till exempel för isolering av celler från näringsmedia. Under centrifugering tillsätts en suspension av partiklar till rotorn kontinuerligt; Rotorns kapacitet beror på den avsatta beredningens karaktär och varierar från 100 cm3 till 1 dm3 per minut. Det speciella med rotorn är att det är en isolerad kammare med en speciell design; dess innehåll kommunicerar inte med den yttre miljön och är därför inte förorenad eller sprutad.

2.6.3 Zonal eller Anderson rotorer

Fyllningen av rotorn utförs när den roterar med en hastighet av cirka 3000 rpm-1. En förskapad gradient pumpas in i rotorn, utgående från ett lager med lägsta densitet, som är jämnt fördelat längs rotorns periferi och hålls vid dess yttre vägg vinkelrätt mot rotationsaxeln på grund av centrifugalkraften. Med efterföljande tillägg av gradientskikt med högre densitet sker en kontinuerlig förskjutning mot mitten av mindre täta skikt. Efter att hela gradienten har pumpats in i rotorn, fylls den till sin fulla volym med en lösning som kallas en "kudde", vars densitet är densamma som eller något överstiger den högsta densiteten för den förformade gradienten.

Sedan, genom det axiella röret, skiktas testprovet, som förskjuts från röret in i rotorns volym med hjälp av en lösning med lägre densitet, medan samma volym av "kudden" avlägsnas från periferin. Efter alla dessa procedurer justeras rotorns rotationshastighet till driftshastigheten, och antingen zonhastighet eller zon-isopycnisk fraktionering utförs under den erforderliga tidsperioden. Extraktion av fraktioner utförs vid en rotorhastighet av 3000 rpm - min-1. Innehållet i rotorn förskjuts genom att lägga till en "kudde" från periferin, först och främst förskjuts mindre täta lager. På grund av den speciella utformningen av den axiella kanalen på Anderson-rotorn sker ingen blandning av zoner under deras förskjutning. Den utgående gradienten förs genom en registreringsanordning, till exempel en spektrofotometercell, med vilken proteinhalten kan bestämmas genom absorption vid 280 nm, eller genom en speciell radioaktivitetsdetektor, varefter fraktioner samlas upp.

Kapaciteten hos zonrotorer som används vid medelhastigheter varierar från 650 till 1600 cm3, vilket gör det möjligt att erhålla en ganska stor mängd material. Zonalrotorer används för att avlägsna proteinföroreningar från olika preparat och för att isolera och rena mitokondrier, lysosomer, polysomer och proteiner.

2.6.4 Analys av subcellulära fraktioner

Analys av distributionen av enzymer i fraktionerad vävnad bygger på två allmänna principer. Den första av dessa är att alla partiklar i en given subcellulär population innehåller samma uppsättning enzymer. Den andra antar att varje enzym är lokaliserat på någon specifik plats i cellen. Om denna position var sann skulle enzymerna kunna fungera som markörer för motsvarande organeller: till exempel skulle cytokromoxidas och monoaminoxidas fungera som mitokondriella markörenzymer, sura hydrolaser som lysosommarkörer, katalas som en peroxisommarkör och glukos-6- fosfatas - mikrosomal membranmarkör. Det visade sig dock att vissa enzymer, till exempel malatdehydrogenas, P-glukuronidas, NADP-H-cytokrom-c-reduktas, är lokaliserade i mer än en fraktion.Därför är valet av enzymmarkörer för subcellulära fraktioner i varje specifik fraktion. fall bör behandlas med stor försiktighet. Dessutom betyder frånvaron av ett markörenzym inte frånvaron av motsvarande organeller.Det är troligt att enzymet under fraktionering förloras av organellerna eller att det hämmas eller inaktiveras, så minst två markörenzymer bestäms vanligtvis för varje fraktion.

Fraktion	Volym, cm"	Allmän avel	Exnulation, 660 nm	Enheter för enzymaktivitet	Aktivitetsutbyte i bråkdel, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Fraktionering genom differentiell centrifugering

2.7.1 Presentation av resultat

2.7.2 Analytisk ultracentrifugering

Analytiska ultracentrifuger kan nå hastigheter upp till 70 000 rpm, samtidigt som de genererar centrifugalacceleration upp till 500 000 g. Deras rotor har som regel formen av en ellipsoid och är ansluten med hjälp av en sträng till motorn, vilket gör det möjligt att variera rotorns rotationshastighet. Rotorn roterar i en vakuumkammare utrustad med en kylanordning och har två celler, analytiska och balanserande, som är installerade i centrifugen strikt vertikalt, parallellt med rotationsaxeln. Balanseringscellen tjänar till att balansera den analytiska cellen och är ett metallblock med ett precisionssystem. Den har också två indexhål placerade på ett strikt definierat avstånd från rotationsaxeln, med hjälp av vilka motsvarande avstånd i den analytiska cellen bestäms. Den analytiska cellen, vars kapacitet vanligtvis är 1 cm3, har en sektoriell form. När den är korrekt installerad i rotorn, trots att den är upprätt, fungerar den på samma princip som en rotor med hängande skopor, vilket skapar nästan idealiska sedimenteringsförhållanden. I ändarna av den analytiska cellen finns fönster med kvartsglas. Analytiska ultracentrifuger är utrustade med optiska system som gör det möjligt att övervaka sedimenteringen av partiklar under hela centrifugeringsperioden. Med förutbestämda tidsintervall kan det sedimenterande materialet fotograferas. Vid fraktionering av proteiner och DNA övervakas sedimentationen genom absorption i ultraviolett ljus, och i de fall de studerade lösningarna har olika brytningsindex, med hjälp av ett schlieren-system eller ett Rayleigh-interferenssystem. De två sista metoderna bygger på att när ljus passerar genom en transparent lösning som består av zoner med olika densitet så bryts ljuset vid zongränsen. Vid sedimentering bildas en gräns mellan zonerna med tunga och lätta partiklar, som fungerar som en brytningslins; i detta fall visas en topp på den fotografiska plattan som används som detektor. Under sedimenteringen flyttas gränsen, och följaktligen toppen, vars rörelsehastighet kan användas för att bedöma materialets sedimentationshastighet. Interferometriska system är känsligare än schlierensystem. Analytiska celler är ensektor, som används oftast, och tvåsektor, som används för jämförande studie av lösningsmedlet och det lösta ämnet.

2.8 Tillämpning av analytisk ultracentrifugering

2.8.1 Bestämning av molekylvikter

Bestämning av molekylvikt genom sedimentationshastighet är den vanligaste metoden. Centrifugering utförs med höga hastigheter, så att partiklarna, initialt jämnt fördelade över hela volymen, börjar röra sig i ordning längs radien från rotationscentrum. Mellan området för lösningsmedlet, som redan är fritt från partiklar, och den del av det som innehåller dem, bildas ett tydligt gränssnitt. Denna gräns flyttas under centrifugering, vilket gör det möjligt att bestämma sedimentationshastigheten för partiklar med en av ovanstående metoder, och registrera denna rörelse på en fotografisk platta.

Sedimentationshastigheten bestäms av följande samband:

där x är avståndet från rotationsaxeln i cm,

t - tid i s,

w är vinkelhastigheten i rad-s-1,

s är sedimentationskoefficienten för "molekylen.

Sedimentationskoefficienten är hastigheten per accelerationsenhet, den mäts i enheter av Seedberg; 1 Swedberg enhet är lika med 10_13 s. Det numeriska värdet för s beror på partiklarnas molekylvikt och form och är ett värde som är karakteristiskt för en given molekyl eller supramolekylär struktur. Till exempel är sedimentationskoefficienten för lysozym 2,15 S; katalas har en sedimenteringskoefficient på 11,35S, bakteriella ribosomsubenheter från 30 till 50S och eukaryota ribosomsubenheter från 40 till 60S.

där M är molekylens molekylvikt, R är gaskonstanten, T är den absoluta temperaturen, s är molekylens sedimentationskoefficient, D är molekylens diffusionskoefficient, v är den partiella specifika volymen, som kan vara betraktad som volymen som upptas av ett gram av det lösta ämnet, är p lösningsmedlet med densitet.

Metod för sedimentationsbalans. Bestämningen av molekylvikter med denna metod utförs vid relativt låga rotorhastigheter, i storleksordningen 7 000-8 000 rpm-1, så att molekyler med hög molekylvikt inte sätter sig till botten. Ultracentrifugering utförs tills partiklarna når jämvikt, som å ena sidan etableras under inverkan av centrifugalkrafter, och diffusionskrafter, å andra sidan, det vill säga tills partiklarna slutar röra sig. Sedan, enligt den resulterande koncentrationsgradienten, beräknas ämnets molekylvikt "enligt formeln

där R är gaskonstanten, T är den absoluta temperaturen, ω är vinkelhastigheten, p är densiteten för lösningsmedlet, v är den partiella specifika volymen, cx och c2 är koncentrationen av det lösta ämnet på avstånden r och r2 från rotationsaxel.

Nackdelen med denna metod är att det tar lång tid att uppnå sedimentationsjämvikt - från flera dagar till flera veckor med kontinuerlig drift av centrifugen.

Metoden att närma sig sedimentationsjämvikt utvecklades för att bli av med nackdelarna med den tidigare metoden, förknippad med en stor investering av tid som krävs för att "etablera jämvikt. Med denna metod kan molekylvikter bestämmas när den centrifugerade lösningen är i en Först fördelas makromolekylerna jämnt över hela volymen av den analytiska cellen, sedan, allt eftersom centrifugeringen fortskrider, sedimenterar molekylerna och densiteten av lösningen i meniskområdet minskar gradvis. Förändringen i densitet är noggrant registrerat, och sedan, genom komplexa beräkningar som involverar ett stort antal variabler, bestäms molekylvikten för en given förening av formlerna:

där R är gaskonstanten, T är den absoluta temperaturen, v är den partiella specifika volymen, p är densiteten för lösningsmedlet, dcldr är koncentrationsgradienten för makromolekylen, hm och gd är avståndet till menisken och botten av provröret, cm och sd är koncentrationen av makromolekyler vid menisken och y botten av röret, respektive, Mm och MR är värdena på molekylvikter, bestämt från fördelningen av koncentrationen av ämnet vid menisken respektive botten av röret.

2.8.2 Utvärdering av preparatens renhet

2.8.3 Studie av konformationsförändringar i makromolekyler