Репортерни протеини в слети протеини. Протеиново инженерство Генно инженерство на протеини

ПРОТЕИНОВО ИНЖЕНЕРСТВО, клон на молекулярната биология и биоинженерството, чиито задачи включват целенасочени промени в структурата на естествените протеини и производството на нови протеини с определени свойства. Протеиновото инженерство възниква в началото на 80-те години на миналия век, когато са разработени методи за генно инженерство, които позволяват да се получат различни естествени протеини с помощта на бактерии или дрожди, както и по определен начин да се промени структурата на гените и съответно аминокиселинната последователност ( първична структура) на протеините, които кодират. Базирайки се на принципите на организация на протеиновите молекули, връзката между структурата и функцията на протеините, протеиновото инженерство създава научно обоснована технология за целенасочени промени в тяхната структура. С помощта на протеиновото инженерство е възможно да се увеличи термичната стабилност на протеините, тяхната устойчивост на денатуриращи влияния, органични разтворители и промяна на свойствата на свързване на лиганда. Протеиновото инженерство позволява, чрез замяна на аминокиселини, да се подобри функционирането на ензимите и тяхната специфичност, да се променят оптималните стойности на рН, при които работи ензимът, да се елиминират нежелани странични дейности, да се елиминират участъци от молекули, които инхибират ензимните реакции и да се повиши ефективността на протеинови протеини. лекарстваи така нататък. Например, замяната само на един треонинов остатък с аланинов или пролинов остатък направи възможно повишаването на активността на ензима тирозилтРНК синтетаза с 50 пъти и благодарение на замяната на 8 аминокиселинни остатъка, така наречената термолизин-подобна протеаза от Bacillus stearothermophilus придобива способността да остава активен при 120°C в продължение на няколко часа. Протеиновото инженерство също така включва работа по целенасочени промени в свойствата на протеините с помощта на химически модификации, например въвеждането на фотоактивирани съединения, които променят свойствата на молекулата под въздействието на светлината, етикетни съединения, които позволяват проследяване на пътищата на движение на протеина в клетка или насочването й към различни компоненти на клетката и др.подобни. Такава работа се извършва главно върху рекомбинантни протеини, получени с помощта на методи на генно инженерство.

Протеиновото инженерство може да бъде разделено на две области: рационален дизайн и насочена молекулярна еволюция на протеините. Първият включва използването на информация за структурно-функционалните връзки в протеините, получена чрез физикохимични и биологични методи, както и компютърно молекулярно моделиране, за да се определи кои промени в първичната структура трябва да доведат до желания резултат. По този начин, за да се увеличи термичната стабилност на протеина, е необходимо да се определи неговата пространствена структура, да се идентифицират „слабите“ области (например аминокиселини, които не са силно свързани с тяхната среда) и да се изберат за тях най-добрите опциизамествания с други аминокиселини чрез молекулярно моделиране и оптимизиране на енергийните параметри на молекулата; след това мутирайте съответния ген и след това вземете и проучете мутантния протеин. Ако този протеин не отговаря на зададените параметри, се прави нов анализ и описаният цикъл се повтаря. Този подход най-често се използва в случай на конструиране на изкуствени протеини (de novo протеини) с определени свойства, когато входът е нова аминокиселинна последователност, основно или изцяло определена от човек, а изходът е протеинова молекулас желаните характеристики. Засега обаче по този начин е възможно да се получат само малки протеини de novo с проста пространствена структура и да се въведат прости функционални дейности в тях, например места за свързване на метал или къси пептидни фрагменти, които носят някои биологични функции.

При насочената молекулярна еволюция на протеини с помощта на методи на генно инженерство се получава голям набор от различни мутантни гени на целевия протеин, които след това се експресират по специален начин, по-специално на повърхността на фагите („фагов дисплей“) или в бактериални клетки, за да се направи възможна селекция на мутанти с най-добри характеристики. За целта например гените правилния протеинили техни части са интегрирани във фаговия геном - в гена, кодиращ протеина, разположен на повърхността на фаговата частица. Освен това всеки отделен фаг носи свой собствен мутантен протеин, който има определени свойства, за които се прави селекция. Мутантните гени се произвеждат чрез „смесване“ на набор от гени за подобни естествени протеини от различни организми, обикновено с помощта на метода на полимеразна верижна реакция, така че всеки получен мутантен протеин може да включва фрагменти от много „родителски“ протеини. По същество този подход имитира естествената еволюция на протеините, но с много по-бързи темпове. Основната задача на протеиновия инженер в този случай е да разработи ефективна система за подбор, която ще позволи да се изберат най-добрите мутантни версии на протеини с необходимите параметри. В случай на гореспоменатата задача - да се увеличи термичната стабилност на протеин - селекцията може да се извърши, например, чрез отглеждане на клетки, съдържащи мутантни гени, при повишени температури (при условие, че присъствието на мутантен протеин в клетката се увеличава неговата термична стабилност).

И двете области на протеиновото инженерство имат една и съща цел и се допълват взаимно. По този начин изследването на мутантни варианти на протеини, получени с помощта на методи на молекулярна еволюция, ни позволява да разберем по-добре структурната и функционална организация на протеиновите молекули и да използваме придобитите знания за целевия рационален дизайн на нови протеини. По-нататъшното развитие на протеиновото инженерство позволява да се решат много практически проблеми за подобряване на естествените протеини и получаване на нови за нуждите на медицината, селското стопанство и биотехнологиите. В бъдеще е възможно да се създават протеини с функции, непознати в живата природа.

Лит.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Протеиново инженерство 20 години по-късно // Nature Reviews. Молекулярна клетъчна биология. 2002. том. 3. No12; Патрушев L.I. Изкуствени генетични системи. М., 2004. Т. 1: Генно и протеиново инженерство.

480 търкайте. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Дисертация - 480 RUR, доставка 10 минути, денонощно, седем дни в седмицата и празници

Ефимов Григорий Александрович. Нови генетично модифицирани протеини на базата на рекомбинантни антитела срещу TNF: дисертация... Кандидат на биологичните науки: 01/03/03 / Ефимов Григорий Александрович; [Място на защита: Институт по молекулярна биология V.A.Engelhard RAS] - Москва, 2015 г. - 122 с.

Въведение

Литературен преглед 9

1. История на откриването на tnf 9

2. TNF 10 суперсемейство

3. Структура на системата tnfnfr 12

4. Функции tnf 15

5. Ролята на TNF в патогенезата на ревматоиден артрит и други автоимунни заболявания 16

6. Терапевтично блокиране на tnf 18

7. Странични ефекти и ограничения на antinf терапията 23

8. Нови подходи и перспективи за блокиране на tnf 25

Материали и методи на изследване 29

1. Производство и характеризиране на ново камилско антитяло с един домейн срещу човешки tnf 29

Експресия и пречистване на еднодоменно антитяло Vhh41 29

Оценка на свързването на Vhh41 антитялото с човешки TNF чрез ELISA 30

Изследване на взаимодействието между Vhh41 и човешки TNF чрез метод на повърхностен плазмен резонанс 31

Проучвания върху способността на Vhh41 да блокира човешкия TNF 31

2. Дизайн, подготовка и характеризиране на хибридни протеини на TNF флуоресцентни сензори 32

Конструиране на гени, кодиращи TNF сензори. 32

Експресия и пречистване на TNF флуоресцентни сензори. 33

Анализ на взаимодействието на Vhh41-K с рекомбинантен TNF. 34

Изследване на биологичните свойства на флуоресцентния сензор Vhh41-KTNFin in vitro и in vivo. Z5

Изследване на способността на флуоресцентен сензор да свързва TNF in vivo 36

Прижизнено изследване на експресията на TNF с помощта на получения флуоресцентен сензор...39

3. Получаване и характеризиране на едноверижно ANTINF антитяло 40

Изследване на мише моноклонално антитяло F10 40

Конструиране и експресия на едноверижно антитяло ahT-4 41

Измерване на биологичната активност на едноверижно антитяло ahT-4 42

4. Получаване и характеризиране на химерно antinf антитяло 43

5. Конструиране, производство и характеризиране на биспецифични антитела A9 и MA9 43

Конструиране, експресия и пречистване на антитела A9 и tA9 43 Взаимодействие на антитела A9 и tA9 с рекомбинантен човешки TNF по метода

повърхностен плазмен резонанс 44

Цитотоксичен тест 45

Цитофлуориметрия 45

Оценка на способността на биспецифично антитяло А9 да задържа човешки TNF при

повърхност на макрофагите 45

6. Сравнителна оценка на ефективността на системното и селективно блокиране на TNF на макрофагите 46

Модел на остра хепатотоксичност, предизвикана от прилагане на JIIJC/D-галактозамин 46

Резултати и обсъждане 48

1. Производство и характеризиране на ново рекомбинантно антитяло с единичен домен, което се свързва специфично с човешки TNF, но не блокира неговата биологична активност 50

Създаване на генетичен конструкт, кодиращ рекомбинантно еднодомейново антитяло

Експресия и пречистване на рекомбинантно еднодоменно антитяло Vhh41 52

Анализ на взаимодействието на еднодомейно антитяло Vhh41 с човешки TNF 53

Анализ на способността на антитялото Vhh41 да блокира биологичната активност на човешкия TNF.54

2. Проектиране, производство и характеризиране на TNF молекулярни сензори за интравитално изследване на експресията на tnf на базата на рекомбинантни антитела с единичен домен и червен флуоресцентен протеин 56

Приготвяне на генетични конструкции, кодиращи TNF флуоресцентния сензор Vhh41-Ku

контролни слети протеини 56

Експресия и пречистване на TNF флуоресцентния сензор Vhh41-K. 57

Анализ на взаимодействието на TNF флуоресцентния сензор Vhh41-K с рекомбинантен миши TNF

и лице 58

Изследване на биологичните свойства на флуоресцентния сензор TNF Vhh41-Kin in vitro и in vivo. 61

Изследване на способността на флуоресцентен сензор да свързва TNF in vivo 66

Прижизнено изследване на експресията на TNF с помощта на получения флуоресцентен сензор... 69

3. Получаване и характеризиране на рекомбинантно едноверижно антитяло, което блокира биологичната активност на TNF 72

Измерване на активността на мише моноклонално антитяло F10 72

Конструиране на едноверижно антитяло на базата на променливи фрагменти от бял дроб и

тежки вериги на мише моноклонално антитяло F 10 74

Измерване на активността на едноверижно антитяло ahT-4 75

4. Разработване и анализ на химерно антитяло срещу човешки TNF

Сравнение на кинетиката на взаимодействията на химерното антитяло 13239 и инфликсимаб с

рекомбинантен човешки TNF 77 Сравнение на неутрализиращата активност на химерното антитяло 13239 с активността

инфликсимаб in vitro 79

In vivo анализ на активността на химерно антитяло 13239 80

5. Проектиране, производство и характеризиране на селективен tnf блокер, произведен от клетки от серията моноцити-макрофаги 82

Молекулярно клониране, експресия и пречистване на биспецифични антитела 82

Взаимодействие на антитела A9 и tA9 с рекомбинантен човешки TNF 86

Блокиране на TNF-зависима цитотоксичност in vitro от антитела A9 и tA9 87

Анализ на свързването на антитела A9 и tA9 към повърхността на макрофагите чрез взаимодействие с

повърхностна молекула F4/80 89

Задържане на ендогенно произведен човешки TNF на повърхността на макрофагите

биспецифично антитяло A9 93

6. Физиологично значимо селективно блокиране на tnf, произведен от клетки от моноцитно-макрофагалната линия in vivo 96

Сравнителна оценка на ефективността на целевото блокиране на TNF, произведен от клетки от моноцитно-макрофагалната линия и системното блокиране на TNF в модел на остра

хепатотоксичност 96

Заключение 99

Литература 100

Ролята на TNF в патогенезата на ревматоиден артрит и други автоимунни заболявания

Първият опит с антицитокинова терапия е извършен през 1985 г., когато на мишки е приложен поликлонален анти-NF заешки серум, който предотвратява развитието на летална хепатотоксичност, предизвикана от прилагането на LPS. Подобни резултати са получени при маймуни: бабуини, третирани с мише моноклонално антитяло срещу човешки TNF, оцеляват след интравенозно инжектиране на летална доза E. coli [104].

Първият терапевтичен TNF блокер е разработен на базата на мише моноклонално антитяло А2 с висок афинитет, получено от мишки, имунизирани с човешки TNF. Тъй като антителата от други видове имат значителни разлики в аминокиселинната последователност, те са неподходящи за дългосрочна терапевтична употреба при хора. Следователно, използвайки генно инженерство, мишите постоянни домени на тежките и леките вериги бяха заменени с човешки. Вариабилните области, които свързват антигена, остават непроменени. Такива антитела се наричат ​​химерни. Впоследствие това първо терапевтично антитяло срещу TNF получи международното непатентовано наименование - инфликсимаб.

Една от най-очевидните области на приложение на антиNF терапията е лечението на сепсис. Клиничните проучвания обаче не са показали значими резултати, което очевидно се дължи на факта, че до момента, в който се развие клиничната картина на сепсиса, вече са стартирани необратими сигнални каскади.

По това време вече са натрупани много факти, показващи участието на TNF в патогенезата на ревматоидния артрит, така че това заболяване е избрано като следваща потенциална цел за антиNF терапия. Пилотни проучвания на инфликсимаб при ревматоиден артрит показаха обещаващи резултати, а по-нататъшно рандомизирано, двойно-сляпо проучване потвърди ефективността на антиNF терапията при лечението на автоимунни заболявания. Въпреки това, след многократни инжекции, някои пациенти развиват антитела, специфични за миши аминокиселинни последователности във вариабилните домени, което намалява ефективността на терапията.

Двойно-сляпо, рандомизирано проучване показа, че инфликсимаб има синергичен ефект с ниска доза метотрексат, цитостатик, използван за монотерапия на RA. Когато се комбинират, тези две лекарства са по-ефективни и имуногенността на инфликсимаб е намалена. Последващите фаза II/III клинични изпитвания доведоха до одобрението на инфликсимаб за лечение на RA.

Механизмът на действие на инфликсимаб се дължи главно на свързването на разтворимия TNF в системното кръвообращение и в местата на локална свръхекспресия (синовиална кухина при РА). Но освен това, инфликсимаб е в състояние да се свърже с трансмембранната форма на TNF и да причини лизис на клетките, които го носят на тяхната повърхност чрез механизма на антитяло-зависима цитотоксичност.

AntiNF терапията прекъсва патологичната сигнална каскада и води до намаляване на възпалителния отговор, но освен това е в състояние да балансира нерегулираната имунна система. С въвеждането на TNF инхибитори балансът на Т-ефекторните и Т-регулаторните клетки се измества.

AntiNF терапията не е етиотропна терапия и теоретично трябва да се използва през целия живот на пациента, но в някои случаи е възможно да се постигне стабилна ремисия, която продължава дори след прекратяване на антиNF терапията.

Блокерите на TNF са показали своята ефективност и при лечението на други автоимунни и възпалителни заболявания: доказано е, че TNF играе съществена роля в патогенезата на болестта на Crohn – той е свръхекспресиран във възпалените участъци на червата. Предварителните успехи при лечението на болестта на Crohn, резистентна на стандартна терапия с инфликсимаб, по-късно бяха потвърдени в рандомизирани клинични проучвания, което доведе до одобрението на инфликсимаб за лечение и на това заболяване.

Патогенезата на анкилозиращия спондилит (анкилозиращ спондилит), друго хронично системно автоимунно заболяване, засягащо предимно ставите, също се дължи на свръхекспресия на TNF. Клиничните изпитвания на инфликсимаб са успешни и за това заболяване. В допълнение, antiNF терапията е показала висока ефективност при лечението на псориазис и псориатичен артрит.

Към днешна дата инфликсимаб и други блокери на TNF са одобрени като терапевтични средства за следните автоимунни заболявания: ревматоиден артрит, ювенилен идиопатичен артрит, анкилозиращ спондилит, болест на Crohn, улцерозен колит, псориазис, псориатичен артрит. В допълнение, антагонистите на TNF са показали положителни резултати при лечението на саркоидоза, грануломатоза на Вегенер, болест на Бехчет и други хронични заболявания.

Показания, че TNF играе роля в патогенезата множествена склероза, са потвърдени от експерименти върху лабораторни животни. Прилагането на TNF повишава симптомите на експериментален автоимунен енцефаломиелит при плъхове, а прилагането на antiNF антитела предотвратява развитието на това заболяване.

Въпреки това, клиничните изпитвания за лечение на множествена склероза с инфликсимаб и друг блокер на TNF, ленерцепт (разтворим TNFR1), не дават значим клиничен отговор. Освен това при някои пациенти

Моделно автоимунно заболяване, чиято патогенеза е подобна на патогенезата на множествената склероза. имаше увеличение клинични симптомизаболявания и повишаване на клетъчността и нивото на имуноглобулините в цереброспиналната течност, увеличаване на броя на лезиите при ядрено-магнитен резонанс.

Успехът на инфликсимаб даде тласък на разработването на нови молекули, способни да блокират предаването на сигнал през TNFR. В допълнение, миши последователности във вариабилните домени на тежките и леките вериги на инфликсимаб причиняват производството на вторични антитела при някои пациенти, което блокира ефекта на инфликсимаб и прави пациентите рефрактерни на терапията. За да се преодолее това ограничение, беше предприет път за създаване на инхибитори с изцяло човешки аминокиселинни последователности.

Към днешна дата, в допълнение към инфликсимаб, четири TNF антагониста са одобрени за клинична употреба (вижте Фигура 2):

Етанерцепт е рекомбинантен TNF инхибитор, създаден от разтворим TNFR2. Разработката му се основава на данни, че в човешкото тяло присъства разтворима форма на втория TNF рецептор. TNFR2, „ексфолиран“ от металопротеазите, е допълнителна връзка в регулацията на активността на TNF. Етанерцепт е димер на извънклетъчната част на TNFR2, генетично слят с Fc частта на имуноглобулин IgGl. Свързването с константната област на антитялото значително увеличава полуживота на лекарството в системното кръвообращение поради рециклирането на протеина през FcRn рецептора. Неутрализиращата активност на слетия протеин е демонстрирана както в in vitro, така и в in vivo експерименти и по-късно е потвърдена в клинични изпитвания при пациенти, страдащи от ревматоиден артрит.

Въпреки това, при лечението на възпалителни заболявания на червата, етанерцепт, за разлика от инфликсимаб, не е показал терапевтична ефикасност. Експерименталният TNF блокер onercept, получен от друг TNF рецептор, TNFR1 (p55), въпреки обнадеждаващите пилотни клинични проучвания в рандомизирано, плацебо-контролирано, двойно-сляпо проучване, също не показва ефективност при лечението на болестта на Crohn. Проучване in vitro, изследващо Т-лимфоцити от lamina propria на пациенти с болестта на Crohn, показва, че докато и инфликсимаб, и етанерцепт блокират TNF, само инфликсимаб се свързва с Т-клетките в лезията и индуцира апоптоза в тях. Това може да обясни разликата в ефективността на базираните на антитела и рекомбинантните рецепторни блокери при възпалителни заболявания на червата.

Изследване на взаимодействието между Vhh41 и човешки TNF с помощта на повърхностен плазмен резонанс

Генетичният конструкт, кодиращ биспецифичното антитяло А9, беше сглобен от HSH чрез реакция с 4 праймера, подобни на описаните по-горе за гена на едноверижното антитяло ahT-4. Получената последователност се състоеше от: еднодомеен ген за антиNF антитяло, след това последователност, кодираща линкерен вид (Gly4Ser)3, и едноверижен ген за анти-P4/80 антитяло (любезно предоставен от S. Gordon и M. Stacey) . Местата за разпознаване за рестрикционните ензими Ncol и Xhol бяха включени съответно в последователността на предните и обратните праймери. След ограничаване на PCR продукта и клонирането му в експресионния вектор pET-28b (Novagen), последователността, кодираща полихексидиновия маркер, беше намерена в 3-тия край в същата четяща рамка. За да се получи контролното антитяло wA9, мутантният анти-G4/80 scFv ген, съдържащ глицин-серинови вмъквания вместо CDR последователности, беше синтезиран de-novo (Geneart, Германия) и клониран вместо нативния анти-F4/80 ген (виж Фиг. 31B).

Експресионни вектори, носещи вмъквания, кодиращи А9 и mA9, бяха използвани за трансформиране на Е. coli клетки от щама Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Най-добрите продуциращи клонове бяха избрани чрез имуноблотинг на колонии, използвайки никел-конюгирана пероксидаза (Pierce, 15165). Бактериалните култури се отглеждат в LB среда, съдържаща 50 cg/ml карбеницилин (Sigma-C1389) и 50 cg/ml хлорамфеникол (Sigma-C1863) до логаритмична фаза и след това експресията се индуцира от 0.2 mM IPTG. След 4 часа културите се центрофугират при 3200 g за 30 минути. Пелетите се замразяват и след това се ресуспендират в лизисен буфер (50 mM TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% глицерол, 0,5% Triton X-100 детергент, 10 000 U/ml лизозим, 10 mM Р-меркаптоетанол) и след това се разрушават с помощта на ултразвуков хомогенизатор. Лизатите се центрофугират при 17 000 g за 40 минути, супернатантите се събират и филтруват през филтър с диаметър на порите 0, 22 cm. Биспецифичните антитела А9 и tA9 бяха пречистени от избистрени супернатанти върху хроматографска колона, съдържаща агароза, конюгирана с Ni-нитрилооцетна киселина (Invitrogen R90115). Афинитетната хроматография се извършва съгласно протокола на производителя. Полученият елуат се концентрира, диализира се срещу буфериран с фосфат физиологичен разтвор, последвано от филтруване през 0.22 μm филтър. Концентрацията на протеин в разтвора се измерва с помощта на реакция с 2,2-бицинхонинова киселина (PIERCE 23225 комплект) съгласно протокола на производителя. Хомогенността на получения препарат се тества чрез електрофореза в 15% полиакриламиден гел в присъствието на натриев додецилсулфат, последвано от оцветяване с кумаси.

Взаимодействие на антитела A9 и tA9 с рекомбинантен човешки TNF чрез повърхностен плазмонен резонанс.

Сравнение на афинитетите и кинетиката на взаимодействие на антитела А9 и mA9 с рекомбинантен човешки TNF беше извършено на инструмент ProteOn XPR36 (Bio-Rad). По време на измерването на всички взаимодействия беше използван фосфатно буфериран физиологичен разтвор с рН 7,4, към който беше добавен детергент Tween 20 до концентрация 0,005%, температурата на повърхността на чипа беше 25 С. Рекомбинантен човешки TNF се експресира в E. coli съгласно описания по-горе метод. Антителата A9 и tA9 в концентрация от 50 nM бяха имобилизирани през аминогрупата върху повърхността на биочип с модифицирана алгинатна полимерна повърхност (Bio-Rad 176-5011). След това аналитът (човешки TNF) в пет двойно намаляващи концентрации (50-3 nM) се прилага в пет паралелни канала. Буфер, който не съдържа антитяло, беше въведен в шестия канал за нормализиране. Анализът на получените сензорограми е извършен в програмата ProteOn Manager (Bio-Rad) с помощта на модела Langmuir.

При експерименти с перитонеални макрофаги, перитонеалните клетки бяха изолирани от мишки от див тип (C57BL/6) и незабавно оцветени с помощта на флуорохром-конюгирани антитела. За получаване на макрофаги от костен мозък Костен мозъксе изолира, след което клетките се култивират в продължение на 10 дни в кондиционирана среда (получена на линия L929), след което клетките се отстраняват от пластмасата с леденостуден фосфатен буфер.

Преди оцветяването Fc-гама рецепторът се блокира, след това клетките се инкубират с А9 или tA9 антитела или буфер, след което клетките се промиват и оцветяват по един от трите начина: 1) поликлонални заешки антитела към hTNF-VnH, след това с вторични антитела към заешки IgG, конюгирани с флуорохром. 2) моноклонални миши антитела към хексахистидиновата последователност (Novagen - 70796), след това с вторични антитела към миши IgG, конюгирани с флуорохром. 3) рекомбинантен човешки TNF беше добавен към клетките и след това маркирани с флуорохром моноклонални антиNF антитела (Miltenyi Biotec - клон: ​​cA2).

В допълнение, клетките бяха оцветени с анти-P4/80 и анти-CD 1 lb антитела, конюгирани с флуорохроми. Пробите бяха анализирани на F ACS Aria (BDBiosciences) или на Guava EasyCyte 8HT (Millipore) и получените данни бяха обработени с помощта на софтуер FlowJo (Treestar Inc.).

Оценка на способността на биспецифично антитяло А9 да задържа човешки TNF на повърхността на макрофагите.

Перитонеалните макрофаги от човешки TNF-продуциращи мишки се изолират и посяват при 100 хиляди клетки на ямка в 96-ямкови плаки за култура. Клетките се инкубират в продължение на 2 часа при 37°С, 5% CO2, след което неприкрепените клетки се отмиват с топъл фосфатен буфер. След това клетките се инкубират една нощ при 37°С, 5% СО2. След промиване с 200 μl топъл DMEM, клетките се инкубират с антитела А9 при концентрация от 2 μg/ml или с DMEM за 30 минути при 37°С. След друго промиване клетките се стимулират с LPS (Sigma, L2630) при концентрация от 100 ng/ml. След 4 часа, супернатантите на културата бяха събрани и концентрацията на човешки TNF беше измерена с помощта на комплект ELISA (eBioscience, 88-7346) съгласно протокола на производителя.

Изолира се костен мозък от човешки TNF-продуциращи мишки, след което клетките се култивират в продължение на 10 дни в кондиционирана среда (получена на линия L929), след което клетките се отстраняват от пластмасата с леденостуден фосфатен буфер. Броят на живите клетки се преброява и те се посяват в 96-ямкови плаки при концентрация от 50 000 клетки/ямка. След това клетките бяха допълнени с 250 тМ А9 антитяло или hTNF-VffH антитяло с единичен домейн или празна среда (DMEM). Клетките се инкубират с антитела в продължение на 30 минути. След това ямките се промиват с буфериран с фосфат физиологичен разтвор. След това производството на TNF се стимулира от LPS (Sigma - L2630) при концентрация от 100 ng/ml. След 4 часа, супернатантите бяха събрани и концентрацията на TNF в тях беше измерена с помощта на цитотоксичен тест върху L929 миша фибросаркома линия, като се използва протокол, подобен на описания по-горе.

Изследване на биологичните свойства на флуоресцентния сензор Vhh41-KTNF in vitro и in vivo

Въз основа на експериментални данни, получени от миши щамове, в които Tnf генът е бил изтрит в отделни клетъчни популации, е формулирана хипотеза относно възможните различни функции на TNF, произвеждан от различни видове имуноцити. Така наскоро беше показано, че в модел на експериментална туберкулозна инфекция, TNF, продуциран от Т лимфоцити, но не и от миелоидни клетки, има уникална защитна функция. В допълнение, нашата лаборатория получи данни, показващи патогенните свойства на TNF от миелоидни клетки при автоимунни заболявания. Терапевтично прилаганото пълно блокиране на PMB не отчита тези характеристики. Като част от развитието на тази хипотеза беше избрано специфично инхибиране на TNF, продуциран от клетки от линията моноцити-макрофаги, което би могло да има значително предимство пред системното блокиране на този цитокин. По-специално, непокътнат сигнал от TNF, произведен от В и Т лимфоцити, може да намали честотата странични ефекти, и в допълнение, за да направи антиNF терапията ефективна при тези заболявания, за които предишните TNF блокери не са показали клинична ефективност или дори са причинили увеличаване на симптомите. В допълнение, този подход може потенциално да намали необходимата доза поради целенасоченото доставяне до продуцентските клетки.

За да проверим това предположение, ние конструирахме и тествахме биспецифично антитяло, което с една част се свързва с повърхността на макрофагите поради взаимодействие с трансмембранната молекула F4/80, а с втората специфичност улавя и блокира произвеждания от тях TNF.

Молекулярно клониране, експресия и пречистване на биспецифични антитела. Биспецифичното антитяло, селективен блокер на макрофаг TNF, е наречено А9. За да се създаде генетичната конструкция, която го кодира, бяха използвани еднодомейно анти-NF блокиращо антитяло hTNF-VffH и едноверижно антитяло (scFv) срещу повърхностния маркер на макрофага F4/80 (любезно предоставено от S. Gordon (Университет на Оксфорд , Обединеното кралство) и М. Стейси (Университет на Лийдс, Обединеното кралство) Последователностите, кодиращи двете антитела, бяха амплифицирани с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR) и клонирани в експресионен вектор, така че да са в една и съща четяща рамка и между тях нуклеотидна последователност образува се гъвкав глицин-серинов линкер (GSGGGGSG).В С-края на последователността има последователност, кодираща хистидин хексамер за последващо пречистване на протеин (фиг. 31).

Дизайн на биспецифичното антитяло А9, схематично представяне на неговия механизъм на действие, структурата на генетичните конструкции, кодиращи биспецифичното антитяло А9 и контролното системно TNF блокерно антитяло tA9. (A) Биспецифично антитяло А9 се състои от еднодомейново антитяло (VHH) срещу човешки TNF и едноверижно антитяло (scFv) срещу повърхностната молекула F4/80, експресирана върху моноцити и макрофаги. (B) Принцип на селективно блокиране на TNF, произведен от макрофагите: А9 се свързва с повърхността на макрофагите и улавя TNF, освободен от тяхната повърхност, предотвратявайки навлизането му в системното кръвообращение. (B) Схема на генетичния дизайн на биспецифичното антитяло A9 и контролния системен TNF блокер tA9. Генът на еднодомейн антиNF антитяло е последван от последователност, кодираща гъвкав глицин-серинов линкер и след това едноверижен ген на анти-F4/80 антитяло. Това е последвано от последователност, кодираща хистидин хексамер за афинитетно пречистване. Контролното антитяло tA9 има подобна последователност, с изключение на това, че 6 хиперпроменливи области на анти-P4/80 антитялото са заменени с последователности от типа (Gly3Ser)n, което предотвратява свързването на антитялото с повърхността на макрофагите и го превръща в системен TNF инхибитор.

За изследване на ефектите от специфичното блокиране на TNF, произведен от макрофагите, беше необходим контролен системен блокер. За да се избегнат ефекти, свързани с разликите в афинитета на антитялото, беше решено да се използва блокер с подобно A9 TNF-свързващо място. И за да се изключи влиянието на други фактори, по-специално изоелектричната точка и молекулното тегло, които могат да повлияят на полуживота, контролното антитяло трябва да бъде възможно най-близо в първичната аминокиселинна последователност до тази, която се изследва. Следователно, ние конструирахме контролно антитяло - tA9, което има същата структура и аминокиселинна последователност като А9, с изключение на това, че 6 от неговите хиперпроменливи области в анти-P4/80 scFv бяха заменени с последователности от формата (Gly3Ser)n, същата дължина като оригиналните CDR региони (виж Фиг. 31 B).

И двете антитела се експресират в бактериална система и се пречистват чрез афинитетна хроматография.

Размерът на антитялото А9, определен чрез електрофоретична мобилност и HPLC данни, съответства на изчислената молекулна маса от 45 kDa (фиг. 32). хроматография. Отляво са молекулните тегла на протеините. (B) Хроматограма на биспецифично антитяло А9 (в червено), насложена върху хроматограма на маркери за молекулно тегло. (B) Функция на времето за преминаване на молекулата като функция на молекулното тегло. Изчисленото молекулно тегло на биспецифичното антитяло А9 е 43.4 kDa.

Взаимодействие на антитела А9 и tA9 с рекомбинантен човешки TNF. Кинетиката на взаимодействие на антитела А9 и tA9 с рекомбинантен човешки TNF се измерва чрез повърхностен плазмонен резонанс. За да се направи това, двете антитела в концентрация от 50 nM бяха имобилизирани върху повърхността на сензорния чип, след което рекомбинантен човешки TNF в серийни разреждания от 50-3 nM беше приложен като аналит и кинетиката на взаимодействието беше измерена на ProteOn устройство XPR36. И двете антитела показват висок афинитет: Kd на А9 и tA9 е съответно 85 и 95 рМ. Това потвърждава, че въведените мутации не са повлияли на свързването на TNF. В допълнение, и двете антитела имат сходни параметри на скорост на свързване (Kforward, on-rate) и скорост на дисоциация (Kreverse, off-rate) - показани на фиг. 33 и в табл. 3. Бавната скорост на дисоциация трябва да позволи на антитяло А9 да задържи свързания TNF.

Производство и характеризиране на ново рекомбинантно антитяло с единичен домен, което се свързва специфично с човешки TNF, но не блокира неговата биологична активност

Кинетиката на взаимодействие на антитела А9 и tA9 с рекомбинантен човешки TNF се измерва чрез повърхностен плазмонен резонанс. За да се направи това, двете антитела в концентрация от 50 nM бяха имобилизирани върху повърхността на сензорния чип, след което рекомбинантен човешки TNF в серийни разреждания от 50-3 nM беше приложен като аналит и кинетиката на взаимодействието беше измерена на ProteOn устройство XPR36. И двете антитела показват висок афинитет: Kd на А9 и tA9 е съответно 85 и 95 рМ. Това потвърждава, че въведените мутации не са повлияли на свързването на TNF. В допълнение, и двете антитела имат сходни параметри на скорост на свързване (Kforward, on-rate) и скорост на дисоциация (Kreverse, off-rate) - показани на фиг. 33 и в табл. 3. Бавната скорост на дисоциация трябва да позволи на антитяло А9 да задържи свързания TNF.

Кинетика на взаимодействие на биспецифично антитяло А9 и контролно антитяло tA9 с рекомбинантен човешки TNF. (A) Показани са кривите на взаимодействие (сензограми) на рекомбинантен човешки TNF при концентрации от 50 nM - 3 nM със сензорен чип, върху който са имобилизирани биспецифичното антитяло А9 и контролното антитяло tA9. Абсцисната ос показва времето в секунди, а ординатната ос показва изместването на резонансния ъгъл в конвенционални единици (CU). (B) За всяка група сензорограми бяха изчислени стойностите на скоростта на свързване (op-rate), скоростта на дисоциация (off-rate) и константата на дисоциация (Kd). Получените средни стойности, както и стандартното отклонение (SD), се нанасят върху изоафинитетната диаграма. Диагоналните линии съответстват на посочените стойности на константата на дисоциация.

За да се оцени сравнителната активност на антитяло А9 при инхибиране на биологичните ефекти на TNF, беше извършено цитотоксично изследване върху L929 миша фибросаркома линия. Серийни разреждания на А9 и tA9 антитела бяха добавени към постоянни концентрации на рекомбинантен човешки TNF и актиномицин-D. Според получените данни, антителата А9 и tA9 имат подобна антиNF активност (фиг. 34 А). Освен това беше потвърдено, че активността на биспецифичното антитяло А9 съответства на активността на еднодомейното антиNF антитяло hTNF-VffH, което е част от А9 и tA9 (Фиг. 34 B). 10 10 10

АнтиNF активност на биспецифичното антитяло А9, контролното антитяло mA9 и антитялото с единичен домен hTNF-VffH. (A) Сравнение на активността на биспецифично антитяло А9 и контролно антитяло tA9. Представена е кривата на преживяемост на миши фибросаркомни L929 клетки при едновременно излагане на постоянна доза човешки TNF и намаляващи дози на антитела A9 и mA9. (B) Сравнение на активността на биспецифичното антитяло А9 и еднодомейнното антитяло hTNF-VnH. Кривата на преживяемост на клетките на миши фибросарком L929 е представена при едновременно излагане на постоянна доза човешки TNF и намаляващи дози на антитела A9 и hTNF-VHH.Сравнението е извършено в моларни концентрации, за да се изключи влиянието на разликите в моларна масавърху откриваемата активност на антитялото.

Анализ на свързването на антитела A9 и tA9 към повърхността на макрофагите чрез взаимодействие с повърхностната молекула F4/80.

Способността на биспецифичното антитяло А9 да се свързва специфично с повърхността на макрофагите се оценява чрез поточна цитометрия. За да се направи това, клетките, изолирани от перитонеалната кухина, се инкубират с А9 антитела, след което се оцветяват за макрофаги маркери CD1 lb и F4/80, докато се извършва специфично оцветяване за биспецифичното А9 антитяло чрез антитела срещу VHH ИЛИ антитела към полихистидинов етикет. След това пробите бяха подложени на поточна цитометрия и анализ.

Тези експерименти показаха, че биспецифично антитяло А9 е в състояние да се свърже с повърхността на перитонеалните клетки, експресиращи F4/80 и CD1 lb на тяхната повърхност (моноцити и макрофаги) (Фиг. 35 A - D). В същото време А9 не се свързва с клетките на перитонеалната кухина, които нямат тези маркери (главно лимфоцити) (фиг. 35 E и F). Намаляване на нивото на паралелно анти-F4/80 оцветяване при добавяне на антитялото А9 поради конкуренция между две антитела за свързване с мишената потвърждава, че А9 специфично взаимодейства с тази молекула на клетъчната повърхност (Фиг. 35 G и 3) .

Използва се и името Мас-1. Компонент на рецептора за S3 компонента на системата на комплемента. При мишки се експресира върху моноцити, макрофаги и микроглиални клетки. биспецифично антитяло

Клетките на перитонеалната кухина се инкубират с или без биспецифично антитяло А9 (показано в червено) и след това се оцветяват с флуоресцентно белязани антитела към повърхностни маркери, специфични за моноцитно-макрофаговите клетки и с антитела, специфични за А9. След това получените проби се анализират чрез поточна цитометрия. (A, B, E, G) оцветяване с антитела към VHH домейна. (B, D, E, 3) оцветяване с антитела към полихексидиновата последователност. (A, B) биспецифично антитяло А9 се свързва с клетки, избрани за високи нива на експресия на F4/80 и CD1 lb (макрофаги). В показаната хистограма хоризонталната ос показва стойността на флуоресценцията в канала за оцветяване на A9, а вертикалната ос показва нормализираната честота на възникване на събитието. (C, D) същото под формата на разпръсната хистограма. Хоризонталната ос показва стойността на флуоресценция в канала за оцветяване на A9, а вертикалната ос показва стойността на флуоресценция в канала за оцветяване на F4/80. (D, F) -биспецифично антитяло А9 не се свързва с клетки от перитонеалната кухина, които не експресират F4/80 и CD1 lb (лимфоцити). В показаната хистограма хоризонталната ос показва стойността на флуоресценцията в канала за оцветяване на A9, а вертикалната ос показва нормализираната честота на възникване на събитието. (G, 3) -инкубиране с биспецифично антитяло А9 намалява интензитета на оцветяване за F4/80. В показаната хистограма хоризонталната ос показва стойността на флуоресценция в канала за оцветяване при F4/80, а вертикалната ос показва нормализираната честота на поява на събитието.

Макрофагите от костен мозък се инкубират с биспецифично А9 антитяло (показано в червено), без него (показано в синьо) или с контролно tA9 антитяло (показано в черно) и след това се оцветяват с A9/tA9-специфични антитела. Получените проби са анализирани чрез поточна цитометрия. (A) Биспецифично антитяло А9 се свързва специфично с макрофагите на костния мозък. В показаната хистограма хоризонталната ос показва стойността на флуоресценцията в канала за оцветяване на A9, а вертикалната ос показва нормализираната честота на възникване на събитието. (B) контролното антитяло wA9 не успява да се свърже с макрофагите на костния мозък. В показаната хистограма хоризонталната ос показва стойността на флуоресценция в канала за оцветяване на wA9, а вертикалната ос показва нормализираната честота на поява на събитието.

В допълнение, допълнителни цитофлуорометрични експерименти показаха, че антитялото А9, когато е прикрепено към повърхността на макрофагите, е способно едновременно да свързва екзогенно добавения човешки TNF (фиг. 37). Това потвърждава, че и двете субединици на биспецифичното антитяло са функционално активни по едно и също време и че свързването на два антигена по едно и също време е пространствено възможно.

Клетките на перитонеалната кухина се инкубират с или без биспецифично антитяло А9 (показано в червено), след това с рекомбинантен човешки TNF и след това се оцветяват с флуоресцентно белязани антитела към повърхностни маркери, специфични за моноцитно-макрофаговите клетки, както и антитела, специфични за човешки TNF. Получените проби са анализирани чрез поточна цитометрия. (А) биспецифично антитяло А9 е способно да задържа човешки TNF на повърхността на макрофагите (клетки, избрани за високи нива на F4/80 и CD1 lb експресия). В показаната хистограма хоризонталната ос показва стойността на флуоресценцията в канала за оцветяване с TNF, а вертикалната ос показва нормализираната честота на възникване на събитието. (B) Същите данни под формата на разпръсната хистограма. Хоризонталната ос показва стойностите на флуоресценция в канала за оцветяване с TNF, а вертикалната ос показва стойностите на флуоресценция в канала за оцветяване F4/80.

Методите на генното инженерство, по-специално клонирането на отделни гени или части от тях, както и секвенирането на ДНК, позволиха значително да се подобри методологията на мутагенезата, елиминирайки основните недостатъци на класическите методи за предизвикване на мутации в геномите. Класическият генетичен анализ включва ефекта на мутагенен фактор in vivo върху целия геном, в резултат на което в него възникват случайни мутации, често множество, което значително усложнява идентифицирането на мутанти. Мутантните индивиди се идентифицират чрез променени фенотипни характеристики и природата на мутацията може да бъде определена след секвениране на ДНК. Съвременната локализирана мутагенеза всъщност включва обратни действия: първо, генът, който представлява интерес, или неговият сегмент се клонират, структурата му се определя по време на секвенирането и след това се правят необходимите промени в неговия състав in vitro. Последиците от индуцираната мутация се определят след въвеждането на мутантния ген в оригиналния организъм.

Най-простата версия на локализирана мутагенеза се състои в третиране на клониран ДНК фрагмент с един от мутагенните фактори, но резултатът от такова излагане също ще бъде случайни промени в структурата на фрагмента. По-надеждни и по-често използвани методи за локализирана мутагенеза се извършват без използването на мутагенни фактори. Сред видовете мутации преобладават делеции, инсерции и нуклеотидни замествания.

Изтривания.Тези видове мутации в локализираната мутагенеза се получават с помощта на ендонуклеази. Използват се както рестрикционни, така и неспецифични ендонуклеази. Най-простият случай на използване на рестрикционни ензими е да се разцепи геном с помощта на рестрикционен ензим, който въвежда няколко прекъсвания, за да образува лепкави краища. Получените фрагменти отново се затварят в пръстен с помощта на ДНК лигаза, което може да доведе до образуването на молекули, които не съдържат един от ДНК сегментите. Този подход води до обширни делеции и обикновено се използва в предварителни експерименти за определяне на функцията на относително големи участъци от клонирана ДНК.

Малки заличавания се получават, както следва. Клонираният фрагмент се разцепва във вектора на подходящото място с помощта на рестрикционен ензим (фиг. 21.1). Получената линейна молекула се третира с екзонуклеаза III, която хидролизира една верига на ДНК,

започвайки от края на 3'. Резултатът е набор от молекули с едноверижни 5' опашки с различна дължина. Тези опашки се хидролизират от ssDNA-специфична S1 нуклеаза и се образуват делеции в ДНК. Можете също така да използвате екзонуклеаза Bal 31, която катализира разграждането на двете вериги, като се започне от краищата на линейните ДНК молекули. Протичането на нуклеотичните реакции се регулира чрез промяна на времето на инкубация, температурата и концентрацията на ензима, предизвиквайки образуването на делеции с различна дължина. Получените делеционни варианти на линейна ДНК често са снабдени с линкери преди циклизиране, така че рестрикционните сайтове присъстват в областта на делецията. Има и други модификации на описаните методи.

Инсерции (инсерции).За да се получат вмъквания, клонираната ДНК се смила с рестрикционен ензим или неспецифична ендонуклеаза и след това получените фрагменти се лигират в присъствието на сегмента, който се иска да бъде вмъкнат в ДНК. Най-често като такива сегменти се използват химически синтезирани полилинкери (Глава 20).

Инсерциите, подобно на делециите, могат да нарушат целостта на гена или структурата на неговите регулаторни региони, което води до синтез на дефектен протеин (в случай на разширени делеции или изместване на рамката, обикновено неактивен) или промени в процеса на транскрипция на гена на интереси. По този начин често се получават регулаторни мутанти и се конструират експресионни вектори (Глава 20).

Точкови мутации . Тези мутации са нуклеотидни замествания. За получаването им могат да се използват няколко подхода: дезаминиране на цитозин, включване на нуклеотидни аналози, неправилно включване на нуклеотиди по време на ремонт на празнини и др.

Първият метод се основава на факта, че цитозиновите остатъци в едноверижната ДНК могат да бъдат дезаминирани до образуване на урацил чрез третиране с бисулфитни йони. Едноверижни региони в ДНК обикновено се получават близо до рестрикционни места, например чрез действието на екзонуклеаза III. След третиране с бисулфит, едноверижните празнини се запълват с помощта на ДНК полимераза и краищата се лигират. В местата, където се образува уридилат вместо цитидилат по време на дезаминиране, аденилатът ще заеме комплементарна позиция и по време на репликация на такава молекула GC двойката ще бъде заменена с AT двойка.

Друг подход за предизвикване на замествания е да се третира клонирана ДНК с рестрикционен ензим в присъствието на етидиев бромид, който се вмъква между равнините на базовите двойки и разрушава структурата на дуплекса. В резултат на това се образува само едноверижно прекъсване на ДНК. Създава се малка празнина на мястото на едноверижното скъсване и след това се поправя в присъствието на ДНК полимераза, dATP, dGTP, dCTP и N-4-хидроксицитозин трифосфат вместо dTTP. Хидроксицитозин трифосфатът е включен във веригата вместо тимидилат, но по време на репликацията на ДНК той се сдвоява еднакво добре както с аденилат, така и с гуанилат. В резултат на включването на гуанилат след допълнителен цикъл на репликация, AT→GC заместването ще настъпи на това място (фиг. 21.2). Тъй като при този метод заместването на нуклеотидите се извършва вътрешно

рестрикционно място, става възможно лесното разграничаване между векторите с оригиналната последователност и мутантните. За да направите това, достатъчно е да ги третирате с рестрикционния ензим, използван в експеримента: мутантните молекули няма да претърпят разцепване.

Подобен метод се основава на използването само на три от четирите възможни нуклеотида при запълване на едноверижна празнина с ДНК полимераза. В повечето случаи ензимът спира в точката на молекулата, където се появява комплементарният нуклеотид на липсващия. Понякога обаче ДНК полимеразата прави грешка и включва един от трите налични нуклеотида. Това води до образуването на пръстеновидни молекули, които съдържат несдвоени некомплементарни азотни бази. Когато такива вектори се въведат в бактериални клетки, някои от молекулите ще претърпят възстановяване на такова увреждане. В резултат на това в половината от молекулите след репликация първоначалната последователност ще бъде възстановена, а в другата половина мутацията ще бъде фиксирана. Мутантните молекули могат да бъдат разграничени с помощта на метода, описан по-горе.

Сайт-специфична мутагенеза. Характеризираните методи на локализирана мутагенеза се различават по това, че местата, където възникват мутации, се избират произволно. В същото време техниката на сайт-специфична мутагенеза прави възможно въвеждането на мутации в точно определена област на гена. Това става с помощта на синтетични (получени чрез химичен синтез) олигонуклеотиди с дадена последователност. Методът е удобен с това, че не изисква наличието на удобни рестрикционни сайтове. Методът се основава на образуването на хетеродуплекси между синтетичен олигонуклеотид, съдържащ мутация, и комплементарна едноверижна ДНК във вектора.

Продължете по следния начин. Синтезира се малък олигонуклеотид (8-20 мономера), комплементарен на частта от гена, в която искат да получат мутация. Като част от олигонуклеотид в централен регионпозволяват едно или повече нуклеотидни замествания. Изследваният ген или негов фрагмент се клонира като част от вектор, базиран на фага М13, за да се получи кръгова едноверижна рекомбинантна ДНК. Рекомбинантните вектори се смесват и отгряват с олигонуклеотиди. Настъпва хибридизация на олигонуклеотида с комплементарния регион, докато некомплементарните нуклеотиди остават несдвоени. Олигонуклеотидът действа като праймер в полимеразна реакция, включваща ДНК полимераза in vitro. Пръстенът е затворен от лигази. Получената кръгова молекула се въвежда в клетки на Е. coli, където се извършва частично възстановяване на местата на мутантна репликация. Честотата на мутациите обикновено варира от 1 до 50%. Селекцията на клетки, съдържащи мутантни ДНК молекули, може да се извърши по няколко начина, сред които предимството е методът с използване на радиоактивно белязан олигонуклеотид, който се използва за мутагенеза. В този случай този нуклеотид служи като сонда. Принципът на използване на такава сонда се основава на факта, че тя е напълно комплементарна на мутантната ДНК и частично комплементарна на дивия тип ДНК. Възможно е да се изберат такива условия на хибридизация (предимно температура), че хибридизацията на белязаната проба да бъде стабилна само с мутантната ДНК последователност, която може да бъде открита чрез авторадиография.

Методът на сайт-специфична мутагенеза е особено ценен, тъй като ви позволява да изолирате мутации, без да контролирате фенотипното им проявление. Този метод отваря нови възможности за изучаване на функциите на генните регулаторни елементи, позволява ви да промените „силата“ на промоторите, да оптимизирате местата за свързване на рибозомите и т.н. Едно от основните приложения на тази методология е протеиново инженерство.

Протеиново инженерство. Тази фраза обозначава набор от методологични техники, които правят възможно реконструирането на протеинова молекула чрез целенасочено въвеждане на подходящи мутации в структурен ген (сайт-специфична мутагенеза) и, следователно, желаните аминокиселинни замествания в първичната структура на протеина.

Показателен пример за изграждането на по-активни протеини са опитите на Фершт и сътрудници с ензима тирозил-тРНК синтетаза от бактерията Bacillus stearothermophilus. Анализът на последствията от аминокиселинните замествания в активния център на този ензим доведе до заключението, че отстраняването на групи, които образуват слаби водородни връзки със субстрата, може да подобри неговия афинитет към субстрата. Установено е, че треонин-51 (заема позиция 51 в пептида) образува дълга и слаба водородна връзка с кислорода на рибозния пръстен при свързване на тирозил аденилат. В същото време беше установено, че пролинът заема същата позиция в бактериите E. coli. Сайт-специфичната мутагенеза на гена, който определя структурата на B.stearothermophilus тирозил-тРНК синтетаза, направи възможно заместването thr-51→pro -51в пептида. В резултат на това свързването на АТФ в активния център на ензима рязко се подобри, а каталитичната му активност се увеличи 25 пъти.

Друг, не по-малко значим пример за протеинова реконструкция с практическо значение е модификацията на субтилизин от Bacillus amyloliquefaciens, извършена от Estell et al. Субтилизините са серинови протеинази, секретирани от бацили във външната среда. Тези ензими се произвеждат в голям мащаб от биотехнологичната индустрия и се използват широко в детергентите. Недостатъкът на субтилизините е рязкото намаляване на протеолитичната активност под въздействието на окислители, включително тези, съдържащи се в праховете за пране. Целта на реконструирането на молекулата на BPN субтилизин беше да се стабилизира срещу химическо окисление.

В предварителните експерименти беше установено, че в присъствието на водороден прекис субтилизинът бързо намалява активността поради окисляването на остатъка метионин-222, който се превръща в съответния сулфоксид. Използвайки методи за специфична за мястото мутагенеза, този метионинов остатък беше заменен с всички останали 19 протеинови аминокиселини. Плазмиди с мутантни гени бяха въведени в щамове с делеции в съответните гени и бяха анализирани свойствата на произведените субтилизини. Мутантите със серин и аланин222 се оказаха доста устойчиви на действието на пероксида. Най-активният мутант е този, съдържащ остатъка от цистеин-222, чиято специфична активност е с 38% по-висока от тази на дивия тип щам.

По подобен начин беше възможно да се увеличи активността на b-интерферона. Други постижения на протеиновото инженерство включват изследвания за изясняване на трансформиращата активност на онкопротеините; промяна на термостабилността на ензимите, например получаване на термолабилен ренин и термостабилна а-амилаза; повишаване на ефективността на свързване на инсулина от съответния рецептор на плазмената мембрана поради заместването на хистидин с аспартат в позиция 10 на b-веригата на хормона, както и много други примери. Голям брой продукти на протеиновото инженерство вече са намерили практическо приложение в производствените процеси.

В пептидните библиотеки, обсъдени по-горе, последните са ковалентно свързани с протеина носител. В този си вид те са едни от представителите на хибридни протеини, получени чрез методите на генното инженерство.

В друг случай се използват хибридни протеини за получаване високо нивоекспресия на къси пептиди в бактериални клетки поради стабилизирането на тези пептиди като част от хибридни протеини. Хибридните протеини често се използват за идентифициране и пречистване на трудни за откриване рекомбинантни протеини. Например, чрез прикрепване на β-галактозидаза към С-края на изследвания протеин като репортерен протеин, е възможно да се пречисти рекомбинантният протеин на базата на β-галактозидазна активност, определяйки неговите антигенни детерминанти чрез имунохимични методи. Чрез комбиниране на ДНК фрагменти, съдържащи отворени рамки за четене (ORF) с гените на репортерните протеини, е възможно да се пречистят такива хибридни протеини въз основа на активността на репортерния протеин и да се използват за имунизиране на лабораторни животни. Получените антитела след това се използват за пречистване на естествения протеин, който включва рекомбинантния полипептид, кодиран от ORF, и по този начин идентифицира клонирания генен фрагмент.

С помощта на хибридни протеини се решава и обратната задача за клониране на неизвестен ген, към протеиновия продукт на който има антитела. В този случай, клонирана библиотека от нуклеотидни последователности, представляващи ORF на неизвестни гени, е конструирана във вектори, които позволяват ORF да бъде клонирана, за да бъде свързана в една и съща четяща рамка с репортерния ген. Хибридните протеини, образувани в резултат на експресията на тези рекомбинантни гени, се идентифицират с помощта на антитела, използвайки методи за ензимен имуноанализ. Хибридните гени, комбиниращи секретирани протеини и репортерни протеини, позволяват да се изследват по нови начини механизмите на секреция, както и локализирането и движението на секретираните протеини в тъканите.

1. Хибридни токсини

Поредица от произведения на И. Пастан и неговите колеги върху дизайна на целеви хибридни токсини отлично илюстрира възможностите на протеиновото инженерство по отношение на комбинирането на различни функционални области на протеини за постигане на специфични биологични ефекти.

Ориз. II.22. Целеви лекарства на базата на хибридни токсини

А– обобщена схема на структурата на таргетното лекарство; b– структура на псевдомонас токсин (цифрите показват позицията на аминокиселинните остатъци); V– структура на хибридния токсин; Ж– хибриден токсин на базата на моноклонални антитела

Идеалното лекарство със строго специфично селективно действие трябва да има поне следните структурни и функционални характеристики (фиг. II.22, А). Такова лекарство трябва да съдържа активен принцип за постигане на физиологичен ефект и лиганд, който разпознава рецептор на повърхността на таргетните клетки. В допълнение, той трябва да съдържа структурни елементи, разпознати от транспортната система на тялото за доставяне на лекарството до целевите клетки, както и разделителна област, необходима за отделяне на активния компонент от останалите функционални части на лекарството след доставката му до адреса . Именно тази идеална схема е реализирана в естествения екзотоксин на Pseudomonas aeruginosa. Екзотоксин А P. aeruginosa е протеин, състоящ се от единична полипептидна верига с дължина 613 аминокиселини, която е организирана в три функционални домена (виж Фиг. II.22, b). N-терминалният домен Ia (аминокиселинни остатъци 1–252) е необходим за взаимодействие с повърхността на целевите клетки (прототипът на идеалния лиганд за насочване на лекарството). Функциите на домейна Ib (аминокиселинни остатъци 365–404) понастоящем са неизвестни. Домен II (аминокиселинни остатъци 253–364) осигурява ефективен трансфер на токсина в клетъчния цитозол (система за транспорт на лекарства), а домейн III (аминокиселинни остатъци 405–613) осъществява ADP-рибозилиране на фактора на удължаване на транслацията EF2, който води до потискане на транслацията и клетъчна смърт.мишени. По този начин, за да упражни цитотоксичен ефект, екзотоксин А трябва да разпознае рецептори на клетъчната повърхност, използвайки домейн Ia, да влезе в клетката чрез рецепторно-медиирана ендоцитоза и да бъде преместен през вътрешната мембрана в цитозола, където е локализиран факторът EF2. Основната идея при създаването на целеви токсини беше да се замени домейн Ia с някакъв друг пептиден лиганд, който взаимодейства с различна група рецептори на клетъчната повърхност и по този начин да се промени спецификата на токсина по отношение на самите клетки (виж Фиг. II. 22, V).

Установено е, че премахването на домен Ia чрез методи на генно инженерство рязко (стотици и хиляди пъти) намалява токсичността на такъв пресечен протеин както по отношение на клетки от различни линии, така и in vivo. Прикрепването на човешка молекула интерлевкин 2 към С-терминалната част на пресечения полипептид се извършва чрез комбиниране на структурните части на съответните гени в експресионен вектор. Оказа се, че пречистеният хибриден токсин е изключително токсичен за клетките, носещи на повърхността си рецептори за интерлевкин 2, и няма ефект върху клетките, които нямат тези рецептори и умират под въздействието на естествения токсин. Интернализация(транслокация в клетки) на хибридния токсин се медиира от субединиците р55 и р70 на рецептора на интерлевкин 2. По този начин, в резултат на действието на хибридния токсин върху популация от клетки, някои от които експресират рецептори на интерлевкин 2 на техните на повърхността настъпва селективна смърт на тези клетки.

В тялото повечето Т-клетки в покой и паметта не експресират рецептори за интерлевкин 2 с висок афинитет на тяхната повърхност, докато стимулираните от алоантиген Т-клетки съдържат такива рецептори. Следователно, интраперитонеалното приложение на хибридния токсин на плъхове с експериментален артрит, заболяване, причинено от патологично активиране на Т клетки, намалява симптомите на заболяването. Хибридният токсин значително намалява реакциите на отхвърляне на трансплантант при мишки.

Тези пионерски разработки бяха последвани от цяла поредица от изследвания, насочени към създаване на подобни системи за целенасочена доставка на различни цитотоксични полипептиди. В процеса на по-нататъшно подобряване на целевата система за доставяне на псевдомонас токсин, използвайки интерлевкин 2 като лиганд, те изоставиха пълното премахване на таргетния домейн на токсина и го ограничиха до неговото инактивиране чрез въвеждане на четири специфични за сайта мутации в гена на токсина. Молекулите на такъв хибриден токсин се оказаха 10-100 пъти по-ефективни цитотоксични агенти срещу човешки и маймунски клетки, експресиращи рецептори за интерлевкин 2 на тяхната повърхност, и също така имаха значително по-дълъг полуживот в кръвта на мишки in vivo в сравнение с получената преди това конструкция.

На базата на псевдомонас токсин са създадени хибридни токсини, съдържащи като лиганди полипептидните вериги на интерлевкин 4, интерлевкин 6, трансформиращ растежен фактор тип  и инсулиноподобен растежен фактор I. Доказано е, че всички тези хибридни протеини имат силно специфична цитотоксичност срещу туморни клетки (включително човешки миеломни клетки), имащи съответните рецептори. Използването на част от CD4 полипептидната верига като лиганд в хибридния токсин, гликопротеин на повърхността на Т клетките, който е рецептор на HIV вируса и взаимодейства с неговия гликопротеин gp120, направи възможно селективното заразяване на Т клетките инфектирани с HIV вируса и експресиращи вирусния протеин gp120 на повърхността си.

Същият принцип на потискане на инфекция, причинена от HIV вируси от разтворими CD4 рецептори, е използван при конструирането на хибридни протеини, комбиниращи части от CD4 полипептидните вериги с постоянни части от тежките или леките вериги на човешките имуноглобулини. В този случай, в процеса на комбиниране на гени, нуклеотидните последователности, кодиращи трансмембранните и цитоплазмените домени на CD4, както и променливата част от полипептидните вериги на имуноглобулините, бяха отстранени. Получените хибридни молекули, т.нар имуноадхезини, поради постоянната част от молекулата на имуноглобулина, те придобиват повишена стабилност в тялото и в допълнение запазват специфичните свойства, медиирани от постоянните части на имуноглобулините: свързване на Fc рецептора и протеин А, способността да фиксират комплемента и преминаване през плацентарната бариера. Комбинацията от всички тези свойства направи възможно имуноадхезините ефективно да прекъснат инфекцията на Т клетките с HIV-I вируса, блокирайки както самия вирус, така и клетките, заразени от него, които експресират вирусния антиген gp120 на тяхната повърхност.

По-нататъшно усъвършенстване на конструкти за генно инженерство, базирани на екзотоксин А на псевдомонада, настъпи, след като вариабилните домени на моноклонални антитела към компонента p55 на човешкия интерлевкин 2 рецептор започнаха да се използват като целева част от хибридния токсин. В този рекомбинантен протеин, използвайки 15-мерен пептиден аминокиселинен линкер, вариабилният домен на тежката верига на този имуноглобулин е свързан с вариабилния домен на неговата лека верига, а С-краят на леката верига е свързан с N -края на пресечения псевдомонас токсин (виж Фиг. II.22, Ж). Такива хибридни токсинови молекули също се оказаха силно специфични цитотоксични агенти към човешки левкемични клетки, експресиращи рецептори за интерлевкин 2 на тяхната повърхност.

Разработеният подход демонстрира възможността за използване на специфични антитела като целеви части на хибридни токсини. Това дава на изследователите универсален метод за целенасочено доставяне на токсини, което в бъдеще ще позволи упражняването на цитотоксичен ефект върху всякакви групи клетки, експресиращи специфични антигени на повърхността си, т.е. значително разширяване на броя на мишените за химиотерапевтични ефекти с помощта на рекомбинантни протеини.

В допълнение към псевдомонас екзотоксин А, дифтериен токсин, фактор на туморна некроза и рицин А верига са успешно използвани като активни принципи в хибридни токсини. Тъй като протеинът А селективно взаимодейства с постоянните (Fc) части на имуноглобулините от клас G на много бозайници, такъв хибриден токсин, когато се свърже с имуноглобулин, произведен срещу всеки антиген на повърхността на клетките, селективно се свързва с тези клетки и ги убива. Такива имунотоксини са друг потенциален антитуморен агент и могат да се използват срещу клетки, експресиращи специфични антигени на тяхната повърхност.

Ориз. II.23. Използване на слят протеин за регулиране на генната експресия

Методите на генното инженерство разкриват безкрайни възможности за конструиране на нови протеини чрез комбиниране на различни функционални домени на полипептидни вериги в различни комбинации. Производството на целеви хибридни токсини илюстрира възможностите на този подход в протеиновото инженерство. Като последна илюстрация на възможностите на тази група методи, помислете за слят протеин като нов регулатор на генната активност. При конструирането на такъв протеин с помощта на методи на генно инженерство, ДНК-свързващият домен в рецептора на глюкокортикоидния хормон беше заменен със съответния домен на LexA репресора на Е. coli (фиг. II.23).

Въвеждане на генна операторна последователност lexAв областта на промотора на глобиновия ген (или други гени) води до активиране на промотора под въздействието на хибридния протеин в присъствието на дексаметазон, синтетичен хормон, който взаимодейства с глюкокортикоидния рецептор. Така в новата генетична среда нуклеотидната последователност на генния оператор lexAЕ. coli функционира като усилвател на транскрипцията в присъствието на синтезиран активиращ протеин, който разпознава тази последователност. Резултатите от работата демонстрират възможността за създаване на нови протеини, които регулират генната активност чрез комбиниране на известни функционални домени.

Развитието на протеиновото инженерство до голяма степен се възпрепятства от липсата на знания за структурно-функционалните връзки в протеините, което се дължи на сложността на обекта на изследване. Многобройни работи, насочени към изучаване на такива връзки, като правило имат емпиричен характер и завършват с локализирането на аминокиселини, които са от съществено значение за функционирането на активните центрове на ензимите. Следователно основната задача на протеиновото инженерство - използването на известна последователност от аминокиселинни остатъци за получаване на протеин с желани свойства - в момента все още е далеч от решение. Въпреки това, понякога вече е възможно целенасочено да се променят някои свойства на съществуващите ензими чрез замяна на малък брой аминокиселинни остатъци от техните полипептидни вериги, като се използва целенасочена мутагенеза.

Речник Елуиране Елуирането е метод за извличане на вещество (вирус) от твърд носител чрез измиване Метод на показване Методът на показване е метод за представяне на хетероложни протеини/пептиди на повърхността на вируси, клетки или безклетъчни култури за избиране на протеини или пептиди с необходимите свойства Биосензор Биосензор - аналитична система (биологичен материал + преобразувател), която дава възможност за откриване на вещества в тестовата проба и оценка на техните концентрации Елуиране Елуирането е метод за извличане на вещество (вирус) от твърд носител чрез измиване Метод на показване Методът на показване е метод за представяне на хетероложни протеини/пептиди на повърхността на вируси, клетки или безклетъчни култури за избор на протеини или пептиди с необходимите свойства Биосензор Биосензорът е аналитична система (биологичен материал + конвертор), която ви позволява да откриване на вещества в тестовата проба и оценка на техните концентрации

Протеиново инженерство 4 Набор от методи и подходи за изучаване на протеини и получаване на протеини с нови свойства ОСНОВНИ ЗАДАЧИ Създаване на библиотека с клонинги от нуклеотидни и аминокиселинни последователности Изследване на ефектите от единични замествания на аминокиселинни остатъци върху сгъването и функциите на протеина Разработване на методи за ефективно модифициране протеини, за да им придаде необходимите свойства. Разработване на методи и подходи за скрининг и селекция на протеини с необходимите свойства

Рационален дизайн Рационален дизайн Необходимостта от знания за пространствената организация на протеина Необходимостта от знания за вътрешно- и междумолекулните взаимодействия Несъвършенство на методите и оборудването посока, насочена към създаване на нови протеини de novo чрез техния пространствен дизайн

Насочената еволюция на протеинови молекули е посока, насочена към създаване на нови протеини чрез селекция 1 получаване на библиотека от произволни аминокиселинни последователности 2 избиране на полипептидни вериги, които имат поне малка степен от необходимите свойства 3 използване на случаен мутагенез получаване на нова библиотека от протеини, които са използвани в следващия кръг на селекция или използване на генно инженерни конструкции, експресиращи нови протеини

Насочена еволюция на протеинови молекули (опции) рационален редизайн с помощта на насочена мутагенеза замяна на специфични аминокиселинни остатъци в активния център на ензимното инженерство на протеинови повърхности с помощта на мутации промяна на участъци от полипептидната верига в близост до аминокиселинни остатъци, които са близо един до друг на повърхност на протеиновата глобула, но разположени на значително разстояние в полипептидната верига един от друг

Скрининг и селекция на протеини със специфични свойства случаен скрининг подобрен скрининг селекция всеки протеин се изследва за наличието на необходимите свойства; изборът на протеини от библиотеката се извършва на случаен принцип, всеки протеин се изследва за наличието на необходимите свойства; изборът на протеини от библиотеката се извършва произволно; възможно е, ако обектите, които съставляват библиотеката, се различават фенотипно (например при наличие на ензимна активност); създават се условия за селективно запазване на компонентите на библиотеката, които имат определени свойства (фаг, клетъчен дисплей); създават се условия за селективно запазване на компонентите на библиотеката; които имат определени свойства (фаг, клетъчен дисплей) откриване на протеин с необходимите свойства сред голям брой макромолекули, които съставляват получената библиотека за клонинги

Фагов дисплей Целта е да се покажат чужди протеини на повърхността на фага.Методът е разработен през 1985 г. за нишковидния бактериофаг M13. (гените pIII и pVIII са подходящи целеви места за вмъкване на чужд сДНК фрагмент) Целта е да се изложат чужди протеини на повърхността на фага.Методът е разработен през 1985 г. за нишковидния бактериофаг M13. (гените pIII и pVIII са подходящи целеви места за вмъкване на чужд сДНК фрагмент) се конструира хибриден ген, състоящ се от кодиращите последователности на целевия протеин и един от протеините на обвивката на фага от бактериофага; Е. coli се инфектира по време на фаг. сглобяване; хибридните протеини са включени във фаговата частица

Фагмид Помощен фаг Фагов геном Инфекция на E.coli с помощен фаг Клетки на E.coli, трансформирани с плазмидна библиотека/фагмид се инфектират с помощен фаг, за да се получат фагови частици, на повърхността на които са изложени различни варианти на целевия протеин E. coli клетки, трансформирани с плазмидна библиотека/фагемид, се заразяват с помощен фаг, за да се получат фагови частици, на повърхността на които са изложени различни варианти на целевия протеин

Перспективи за практическото използване на протеиновото инженерство в медицината: *за производство на нови лекарства; за създаване на диагностични средства и производство на ваксини; *за изучаване на механизмите на имунния отговор, както и на заболявания имунна системаЕкология: *за получаване на биокатализатори под формата на цели клетки с имобилизирани на повърхността им ензими; *за получаване на биосензори за целите на диагностиката и мониторинга заобикаляща среда; *за създаване на биоадсорбенти за отстраняване на токсични вещества и йони на тежки метали от околната среда

Измерване на глюкоза с помощта на ензимен електрод (схематично представяне на експеримента на Л. Кларк). Окисляване на глюкоза от ензима глюкозооксидаза в присъствието на кислород: глюкоза + O 2 H 2 O 2 + глюконо-1,5-лактон. H 2 O 2 се редуцира върху платиновия електрод при потенциал от +700 mV; токът, протичащ във веригата, е пропорционален на концентрацията на водороден пероксид (т.е. индиректно на глюкоза).

Речник Имобилизация Имобилизацията е ограничаване на мобилността на молекулите и тяхното потвърждаване на пренареждане Aerotank Aerotank е система за пречистване на отпадъчни води, резервоари, в които се извършва смесване на SW, микробна утайка и въздух. бактерии при анаеробни условия Биоремедиация Биоремедиацията е набор от методи за пречистване на вода, почва и атмосфера, използващи метаболитния потенциал на биологични обекти - растения, гъби, насекоми, червеи и други организми Имобилизация Имобилизацията е ограничаване на мобилността на молекулите и тяхното потвърждаващо пренареждане Aerotank Aerotank е система за пречистване на отпадъчни води, резервоари, в които се смесват SW, микробна утайка и въздух. Digester Digester е резервоар за биологична обработка на органични замърсители с помощта на бактерии при анаеробни условия. Биоремедиация. Биоремедиацията е набор от методи за пречистване на вода, почва и атмосферата, използвайки метаболитния потенциал на биологични обекти - растения, гъби, насекоми, червеи и други организми

Класификация на ензимите Клас Катализирани реакции Примери за ензими Оксидоредуктази Редуктивни и окислителни реакцииИзвестни са над 200 ензима. Каталаза, глюкозооксидаза Трансферази Обратим трансфер на групи атоми от донори към акцептори. Известни са над 450 ензима. Пируват киназа, протеин киназа Хидролази Реакции на хидролиза Познати са над 200 хидролази. Протеаза, амилаза, целулаза Лиази Нехидролитично отцепване на групи от атоми от субстрата за образуване на двойни връзки Познати са над 100 лиази. Аспартаза, фумараза Изомерази Вътрешномолекулни реакции на пренареждане на органични съединения Познати са над 50 ензима. Глюкозоимераза Лигази Реакции на свързване на две различни молекули една към друга Известни са повече от 100. ДНК лигаза, триптофан синтетаза

Микроорганизми Източници на ензими Бацилите са биосинтезатори на рибонуклеази, дезоксирибонуклеази и протеази, а дрождите са глюкоамилази, инвертази и кисела фосфатаза растения Амилазите се изолират от ечемик, кисела фосфатаза от картофи, пероксидаза от хрян животни Лактат дехидрогеназа се изолира от сърцето на едър рогат добитък, алкална фосфатазата се изолира от стомаха. Стомахът на свинете се използва за получаване на пепсин.Лактатдехидрогеназата се изолира от сърцето на говедата, а алкалната фосфатаза се изолира от стомаха. Свинският стомах се използва за производството на пепсин

Методи за имобилизация Физически методиХимични методи: адсорбция върху неразтворим носител, включване в порите на гела, пространствено разделяне с помощта на полупропусклива мембранаа други се основават на създаването на нови ковалентни връзки между ензима и носителя

Предимствата на имобилизираните ензими са отделянето на ензимите от реакционната среда, спирането на реакцията в точното време и получаването на продукт, който не е замърсен с ензима; провеждане на процеса в непрекъснат режим и регулиране на скоростта на реакцията; промяна на свойствата на катализатора, неговата специфичност, зависимост от реакционните условия и чувствителност към денатуриращи влияния; регулират каталитичната активност на ензима чрез въздействие върху носителя

Ензими в биотехнологично производство Източник на ензим, метод на имобилизация Биотехнология Ацетил неутраминат -9-фосфат синтаза Ензим Е. coli. Вграждане в полиакриламиден гел. Синтез на сиалови киселини. Пероксидазен ензим от хрян. Съполимеризация и включване на алгинат в гела. Окисляване на фенол в отпадъчни води. 3-кетостероид дехидрогеназа Клетки на Mycobacterium globiformis. Вграждане в полиакриламиден гел. Трансформация на хидрокортизон в преднизолон

Лавряшина М.Б. KemSU Методи на екологични биотехнологии Биологично пречистване на отпадъчни води Био(фито)ремедиация Създаване на биобезопасни инсектициди и хербициди Създаване на биобезопасни инсектициди и хербициди Производство на екологично чиста енергия Създаване на устойчиви на болести земеделски растения Бактериално излужване на метали Клониране на застрашени и изчезнали животински видове

Методи за пречистване на отпадъчни води Механични (утаяване, филтриране) Механични Химични (излагане на реагенти) Химични Физико-химични Биологични (биохимично самопречистване)) Биологични Най-важният проблем на биотехнологиите е пречистването на отпадъчните води

Аеротенките работят заедно с хомогенизатор, утаителни резервоари, регенератор на утайки и уплътнител (преса). Aerotank Aerotank (от aero и английски tank tank, tank) утаителен резервоар хомогенизатор AEROTENK регенератор на утайки преса пречистена отпадъчна вода активна утайка биорегенератор за отпадъчни води

Дигестер Дигестер (от метан и английски tank - резервоар, резервоар) Групи бактерии Изходни вещества Продукти ХИДРОЛИТИЧНИ АЦЕТОГЕННИ Органични замърсители Висши мастни киселини ПРОИЗВОДСТВО НА ВОДОРОД Висши мастни киселини H 2, CO 2, CH 3 COOH МЕТАНОБРАЗУВАЩИ H 2, CO 2, CH 3 COOH CH 4, CO 2

Фази на метанова ферментация 1 биохидролиза на полимери и ацидогенеза ( органична материяпреминават във висши мастни киселини, ацетат и водород) 2 ацетогенеза и дехидрогениране (ацетат и водород се образуват от висши мастни киселини) 3 метаногенеза (метан, водород и въглероден диоксид се образуват от ацетат)

Фаза I. РАЗРУШАВАЩ ЦЕЛУЛОЗА (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) ПРОТЕОЛИТИЧЕН ПРОТЕОЛИТИЧЕН (Clostridium, Petrococcus) Фаза II. АЦЕТОГЕНЕН (Syntrophobacter wolinii) III фаза. МЕТАНОБРАЗУВАЩИ (Metanobacterium thermoautotrophicum, Metanococcus vannielii) Примери за микроорганизми

БИОМЕДИАЦИЯ Методът се основава на способността на микроорганизмите да използват сложни органични вещества с разграждането им до прости „биологично безопасни” вещества Молекулярна биология и генетика Екология Инженерни науки МикробиологияБИОРЕМЕДИАЦИЯ

Биоремедиация. Подходи. Използване на дейността на естествени „диви” микроорганизми Използване на дейността на естествени „диви” микроорганизми (необходим е усилвател, например O 2) Използване на активни щамове, въведени под формата на биологични продукти на места с интензивно замърсяване

Проучване на биоразнообразието на замърсените територии Изолиране на микрофлора, способна да унищожи отстранените замърсители Активиране на местната микрофлора (биостимулация). Въвеждане на специални микроорганизми-деструктори в замърсени зони (биоремедиация) Биоремедиация. Етапи.

ЗАМЪРСЯВАНЕ Химичен анализИнженерни технологии Биостимулация (Естествени микробни съобщества) Биостимулация Биоремедиация (Изкуствени микробни биологични продукти) Биоремедиация Биоремедиационен мониторинг Биофиторемедиация (Съобщества от растения и микроорганизми) Биофиторемедиация

Конструиране на трансгенни растения, устойчиви на насекоми вредители 1. СИНТЕЗ НА СПЕЦИФИЧНИ ТОКСИНИ 2. СИНТЕЗ НА ХИДРОЛИТИЧНИ ЕНЗИМИ, ДЕЙСТВАЩИ ВЪРХУ КЛЕТЪЧНИТЕ СТЕНИ НА ЛАРВИТЕ НА НАСЕКОМИТЕ И ДРУГИ ВРЕДИТЕЛИ И ПАТОГЕНИ /ХИТИНАЗА, -1,3- ГЛЮКОНАЗА, PR-B ЕЛХИ/ 3. СИНТЕЗ НА ПРОТЕИНАЗНИ ИНХИБИТОРИ И ИНХИБИТОРИ НА ЕНЗИМИ, КОИТО РАЗГРАЖДАТ РАСТИТЕЛНИТЕ ПОЛИЗАХАРИДИ 4. МОДИФИКАЦИЯ НА ВТОРИЧНИЯ МЕТАБОЛИЗЪМ НА РАСТЕНИЯТА ЗА: А) ОГРАНИЧАВАНЕ НА НЕОБХОДИМИТЕ ВЕЩЕСТВА Б) СИНТЕЗ НА НОВИ РЕПЕЛЕНТИ И ТОКСИНИ 5. РЕГУЛ ДЕЙСТВИЕ НА ЗАЩИТНАТА РЕАКЦИЯ: A) ТЪКАННО СПЕЦИФИЧНА ЕКСПРЕСИЯ НА ГЕН B) РЕГУЛИРАНЕ НА ГЕННАТА ЕКСПРЕСИЯ ЧРЕЗ РАЗЛИЧНИ ЕСТЕСТВЕНИ И ИЗКУСТВЕНИ ФАКТОРИ Повишена резистентност на трансгенните растения към гъбния патоген Phomopsis helianhi Повишена резистентност на трансгенните растения към гъбния патоген Phomopsis helianhi A B A - нетрансгенно растение B - трансгенно растение A - не- transgenic plant B - трансгенно растение

Примерен списъктеми, включени в теста за тест 1. История на биотехнологиите. Характеристика на историческите периоди. Най-значимите открития, изиграли важна роля в развитието на науката. 2. Общи понятиябиотехнология: биотехнологична система, биотехнологичен процес, биотехнологичен обект. 3. Биотехнологични обекти, определение, характеристики на мястото на биологичен обект в биотехнологична система, класификация, примери практическо приложение. 4. Микроорганизмите като биологични обекти. Примери, практическа употребав биотехнологиите. 5. Клетъчни и тъканни култури като биологични обекти. Примери, практическо приложение в биотехнологиите. 6. Биотехнологичен процес. Етапи. Кратко описание на етапите на биотехнологичния процес. 7. Характеристики на микроорганизмите като обекти на селекция. Селекция на микроорганизми в биотехнологиите. 8. Мутагенеза: определение, форми на мутагенеза, мутагенни фактори. 9. Селекция на мутантни микроорганизми, създадени по време на селекционния процес в подготвителния етап на биотехнологичния процес. 10. Селекция на биологични обекти. Етапи, подходи, методи.

11. Генно инженерство: предназначение, технология, биологични обекти, примери за практическо приложение, съвременни постижения. 12. Ензими за генно инженерство. Класификация, характеристики на катализираните реакции. 13. Методи за получаване на ген в генното инженерство. Кратко описание, предимства и недостатъци на методите. 14. Вектори в генното инженерство. Определение, класификации, изисквания, кратко описание навектори. 15. Рекомбинантна ДНК. Определение, цел, методи за получаване на рекомбинантна ДНК в генното инженерство. 16. Методи за въвеждане на рекомбинантна ДНК в реципиентна клетка и селекция на модифицирани клетки в генното инженерство. 17. Трансгенеза на растения. вектор. Основни стратегии. Методи за въвеждане на трансгени и селекция на трансгенни организми. 18. Трансгенеза на животни. вектор. Основни стратегии. Методи за въвеждане на трансгени и селекция на трансгенни организми. 19. Клетъчно инженерство: предназначение, технология, биологични обекти, примери за практическо приложение, съвременни постижения. 20. Методи за култивиране на растителни клетки и тъкани. Условия на култивиране, класификация и кратка характеристика на растителните култури в клетъчното инженерство

21. Соматични растителни хибриди. Техника на производство, съвременни постижения, примери за практическо приложение. 22. Протопласти: определение, използване в клетъчното инженерство, методи и условия за изолиране на протопласти. 23. Култивиране и сливане на протопласти в клетъчното инженерство. Методи, условия, фузогени. 24. Практическо използване на клетъчни и растителни тъканни култури. Биосинтеза и биотрансформация, микроразмножаване, примери за трансгенни растения с ценни свойства. 25. Инженерство на животински клетки. Методи, обекти, технология, съвременни постижения, практическо приложение. 26. Култури от животински клетки и тъкани. Класификации на културите, условия на отглеждане, среди, методи за получаване на соматични хибриди, практическо приложение. 27. Стволови клетки. Характеристика. Класификация. Перспективи за приложение. 28. Клониране. Характеристики на метода. Класификация. Перспективи за приложение. 29. Биотехнологичен процес. Етап на култивиране. Основни етапи, характеристики на среди за микроорганизми, растителни и животински клетки. Оборудване. 30. Биотехнологичен процес. Етап на култивиране. Режими на култивиране на биологични обекти. Етапи на растеж на културата в биореактор, синтез на целевия продукт.

31. Биотехнологичен процес. Етап на получаване на продукта. Основни етапи и методи за разделяне и пречистване на биотехнологичен продукт. Примери за биотехнологични продукти. 32. Екологични биотехнологии: предназначение, методи, биологични обекти, примери за практическо приложение, съвременни постижения. 33. Екологични биотехнологии. проблем пия вода. Аеробни методи за пречистване на отпадъчни води. 34. Екологични биотехнологии. Проблем с питейната вода. Анаеробни методи за пречистване на отпадъчни води. 35. Екологични биотехнологии. Биоремедиация, биофиторемедиация. 36. Биотехнология: цел, предмет, цели, основни направления на биотехнологията. Съвременни постижения в областта на биотехнологиите. 37. Инженерна ензимология. Гол, проблеми. Перспективи. Източници на ензими. 38. Имобилизирани ензими. Предимства, методи за обездвижване. 39. Имобилизирани ензими. Носачи за обездвижване, практическо приложение. 40. Протеиново инженерство. Насоки, методи, перспективи.