PROTEIN ENGINEERING, en gren inom molekylärbiologi och bioteknik, vars uppgifter innefattar målmedveten förändring av naturliga proteiners struktur och framställning av nya proteiner med önskade egenskaper. Proteinteknik uppstod i början av 1980-talet, när genteknikmetoder utvecklades som gjorde det möjligt att erhålla olika naturliga proteiner med hjälp av bakterier eller jäst, samt att förändra geners struktur på ett visst sätt och följaktligen aminosyrasekvensen ( primär struktur) av proteinerna de kodar för. Baserat på principerna för organisering av proteinmolekyler, förhållandet mellan proteiners struktur och funktion, skapar proteinteknik en vetenskapligt baserad teknologi för riktade förändringar i deras struktur. Med hjälp av proteinteknik är det möjligt att öka den termiska stabiliteten hos proteiner, deras motståndskraft mot denaturerande effekter, organiska lösningsmedel och att förändra deras ligandbindande egenskaper. Proteinteknik gör det möjligt att, genom att ersätta aminosyror, förbättra funktionen hos enzymer och deras specificitet, att ändra de optimala pH-värdena vid vilka enzymet verkar, att eliminera oönskade sidoaktiviteter, att eliminera molekylära regioner som hämmar enzymatiska reaktioner, att öka effektiviteten av proteinproteiner. mediciner etc. Till exempel möjliggjorde ersättningen av endast en treoninrest med en alanin- eller prolinrest en 50-faldig ökning av aktiviteten hos tyrosyl tRNA-syntetasenzymet, och på grund av ersättningen av 8 aminosyrarester, den så kallade termolysinliknande proteas från Bacillus stearothermophilus förvärvade förmågan att upprätthålla aktivitet vid 120°C under flera timmar. Proteinteknik inkluderar också arbeten på riktad förändring av proteiners egenskaper med hjälp av kemiska modifieringar, till exempel införandet av fotoaktiverade föreningar som förändrar egenskaperna hos en molekyl under inverkan av ljus, märkföreningar som gör det möjligt att spåra ett proteins vägar i en cell eller dirigera den till olika komponenter i en cell, och så vidare liknande. Sådant arbete utförs huvudsakligen på rekombinanta proteiner erhållna med hjälp av genteknikmetoder.
Två riktningar kan särskiljas inom proteinteknik: rationell design och riktad molekylär utveckling av proteiner. Den första innebär användning av information om de strukturella-funktionella sambanden i proteiner, erhållen med fysikalisk-kemiska och biologiska metoder, samt datormolekylär modellering, för att avgöra vilka förändringar i den primära strukturen som ska leda till det önskade resultatet. Så för att öka den termiska stabiliteten hos ett protein är det nödvändigt att bestämma dess rumsliga struktur, identifiera "svaga" områden (till exempel aminosyror som inte är starkt förknippade med deras miljö) och välja de bästa alternativen substitutioner för andra aminosyror med användning av molekylär modellering och optimering av molekylens energiparametrar; efter det, mutera motsvarande gen, och erhåll och analysera sedan det muterade proteinet. Om detta protein inte uppfyller de angivna parametrarna, gör en ny analys och upprepa den beskrivna cykeln. Detta tillvägagångssätt används oftast vid konstruktion av artificiella proteiner (proteiner de novo) med önskade egenskaper, när inmatningen innehåller en ny aminosyrasekvens, huvudsakligen eller helt specificerad av en person, och utmatningen är proteinmolekyl med önskade egenskaper. Än så länge kan dock endast små de novo-proteiner med en enkel rumslig struktur erhållas på detta sätt och enkla funktionella aktiviteter kan införas i dem, till exempel metallbindningsställen eller korta peptidfragment som bär alla biologiska funktioner.
I den riktade molekylära utvecklingen av proteiner erhålls en stor uppsättning olika muterade gener av målproteinet genom genteknik, som sedan uttrycks på ett speciellt sätt, i synnerhet på ytan av fager (”fagdisplay”) eller i bakterieceller, för att göra det möjligt att välja mutanter med de bästa egenskaperna. För detta ändamål till exempel gener rätt protein eller delar av den är integrerad i fagens genom - i sammansättningen av genen som kodar för proteinet som ligger på ytan av fagpartikeln. Samtidigt bär varje enskild fag sitt eget mutantprotein, som har vissa egenskaper, enligt vilka urvalet görs. Mutantgener produceras genom att "mixa" en uppsättning gener från liknande naturliga proteiner från olika organismer, vanligtvis med användning av polymeraskedjereaktionsmetoden, så att varje resulterande mutantprotein kan inkludera fragment av många av "förälder"-proteinerna. I huvudsak härmar detta tillvägagångssätt den naturliga utvecklingen av proteiner, men bara i en mycket snabbare takt. Huvuduppgiften för en proteiningenjör i detta fall är att utveckla ett effektivt urvalssystem som gör det möjligt att välja de bästa mutantproteinvarianterna med de önskade parametrarna. I fallet med ovanstående uppgift - att öka proteinets termiska stabilitet - kan selektion utföras till exempel genom att odla celler som innehåller mutanta gener vid en förhöjd temperatur (förutsatt att närvaron av ett mutant protein i cellen ökar dess termisk stabilitet).
Båda dessa områden inom proteinteknik har samma mål och kompletterar varandra. Således gör studiet av mutanta proteinvarianter erhållna med molekylära evolutionsmetoder det möjligt att bättre förstå den strukturella och funktionella organisationen av proteinmolekyler och använda kunskapen för målmedveten rationell design av nya proteiner. Ytterligare utveckling av proteinteknik gör det möjligt att lösa många praktiska problem med att förbättra naturliga proteiner och få nya för medicinens, jordbrukets och bioteknikens behov. I framtiden är det möjligt att skapa proteiner med funktioner som är okända i naturen.
Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Proteinteknik 20 år senare // Naturrecensioner. Molekylär cellbiologi. 2002 vol. 3. Nr 12; Patrushev L. I. Artificiella genetiska system. M., 2004. Vol 1: Genetisk och proteinteknik.
480 rub. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Avhandling - 480 rubel, frakt 10 minuter 24 timmar om dygnet, sju dagar i veckan och helgdagar
Efimov Grigory Alexandrovich. Nya genetiskt modifierade proteiner baserade på rekombinanta antikroppar mot TNF: avhandling... Kandidat för biologiska vetenskaper: 03.01.03 / Efimov Grigory Alexandrovich; [Place of protection: Institute of Molecular Biology uppkallad efter V.A. - 122 sid.
Introduktion
Litteraturrecension 9
1. Historien om att öppna tnf 9
2. Superfamilj tnf 10
3. Systemstruktur tnfnfr 12
4. tnf-funktioner 15
5. TNF:s roll i patogenesen av reumatoid artrit och andra autoimmuna sjukdomar 16
6. Terapeutisk blockering tnf 18
7. Biverkningar och begränsningar av anti-inf terapi 23
8. Nya tillvägagångssätt och perspektiv för tnf-blockering 25
Forskningsmaterial och metoder 29
1. Framställning och karakterisering av en ny kamel-endomän anti-human tnf-antikropp 29
Uttryck och rening av enkeldomänantikropp Vhh41 29
Utvärdering av bindningen av Vhh41-antikroppen till human TNF genom ELISA 30
Studie av interaktionen mellan Vhh41 och human TNF genom ytplasmaresonans 31
Studier av förmågan hos Vhh41 att blockera human TNF 31
2. Konstruktion, produktion och karakterisering av hybridproteiner av TNF-fluorescerande sensorer 32
Konstruktion av gener som kodar för TNF-sensorer. 32
Uttryck och rening av fluorescerande TNF-sensorer. 33
Analys av interaktionen av Vhh41-K med rekombinant TNF. 34
Undersökning av de biologiska egenskaperna hos den fluorescerande sensorn Vhh41-KTNFin vitro och in vivo. Z5
Studie av förmågan hos en fluorescerande sensor att binda TNF in vivo 36
In vivo-studie av TNF-uttryck med den resulterande fluorescerande sensorn...39
3. Produktion och karakterisering av en enkelkedjig ANTINF-antikropp 40
Studie av mus monoklonal antikropp F10 40
Konstruktion och uttryck av enkelkedjig antikropp ahT-4 41
Mätning av den biologiska aktiviteten av ahT-4 enkelkedjiga antikroppen 42
4. Framställning och karakterisering av chimär anti-inf-antikropp 43
5. Konstruktion, beredning och karakterisering av A9 och MA9 bispecifika antikroppar 43
Konstruktion, uttryck och rening av antikropparna A9 och tA9 43 Interaktion mellan antikropparna A9 och tA9 med rekombinant human TNF-metod
ytplasmaresonans 44
Cytotoxiskt test 45
Cytofluorimetri 45
Utvärdering av förmågan hos den bispecifika antikroppen A9 att behålla human TNF för
yta på makrofager 45
6. Jämförande utvärdering av effektiviteten av systemisk och selektiv blockering av makrofag-TNF 46
Modell av akut levertoxicitet inducerad av administrering av JIIJC/D-galaktosamin 46
Resultat och diskussion 48
1. Erhållande och karakterisering av en ny rekombinant enkeldomänantikropp som specifikt binder till human TNF, men som inte blockerar dess biologiska aktivitet 50
Skapande av en genetisk konstruktion som kodar för en rekombinant enkeldomänantikropp
Uttryck och rening av rekombinant enkeldomänantikropp Vhh41 52
Analys av interaktionen av enkeldomänantikropp Vhh41 med human TNF 53
Analys av förmågan hos Vhh41-antikroppen att blockera den biologiska aktiviteten hos human TNF.54
2. Konstruktion, produktion och karakterisering av TNF-molekylära sensorer för in vivo-studie av tnf-uttryck baserat på rekombinanta antikroppar i en domän och rött fluorescerande protein 56
Erhålla genetiska konstruktioner som kodar för TNF Vhh41-Ku fluorescerande sensor
kontrollfusionsproteiner 56
Uttryck och rening av TNF Vhh41-K fluorescerande sensor. 57
Analys av interaktionen av den fluorescerande sensorn TNF Vhh41-K med rekombinant mus TNF
och människa 58
Studie av de biologiska egenskaperna hos den fluorescerande sensorn TNF Vhh41-Kin vitro och in vivo. 61
Studie av förmågan hos en fluorescerande sensor att binda TNF in vivo 66
In vivo-studie av TNF-uttryck med den erhållna fluorescerande sensorn... 69
3. Framställning och karakterisering av en rekombinant enkelkedjig antikropp som blockerar den biologiska aktiviteten av TNF 72
Mätning av aktivitet av mus monoklonal antikropp F10 72
Konstruktion av en enkelkedjig antikropp baserad på variabla fragment av lungan och
tunga kedjor av mus monoklonal antikropp F 10 74
Mätning av aktiviteten av enkelkedjig antikropp ahT-4 75
4. Utveckling och analys av en chimär anti-human TNF-antikropp
Jämförelse av kinetiken för interaktioner mellan den chimära antikroppen 13239 och infliximab med
rekombinant human TNF 77 Jämförelse av den neutraliserande aktiviteten hos den chimära antikroppen 13239 med den hos
infliximab in vitro 79
Analys av aktiviteten av den chimära antikroppen 13239 in vivo 80
5. Design, produktion och karakterisering av en selektiv tnf-blockerare producerad av celler i monocyt-makrofager-serien 82
Molekylär kloning, uttryck och rening av bispecifika antikroppar 82
Interaktion av A9- och mA9-antikroppar med rekombinant human TNF 86
Antikropparna A9 och rA9 blockerar TNF-beroende cytotoxicitet in vitro 87
Analys av bindningen av antikropparna A9 och tA9 till makrofagernas yta genom interaktion med
ytmolekyl F4/80 89
Retention av endogent producerad human TNF på ytan av makrofager
bispecifik antikropp A9 93
6. Fysiologiskt signifikant selektiv blockering av tnf producerad av celler i monocyt-makrofagerserien in vivo 96
Jämförande utvärdering av effektiviteten av riktad blockering av TNF producerad av celler i monocyt-makrofager-serien och systemisk blockering av TNF i en modell av akut
hepatotoxicitet 96
Slutsats 99
Referenser 100
TNF:s roll i patogenesen av reumatoid artrit och andra autoimmuna sjukdomar
Den första erfarenheten av anti-cytokinterapi genomfördes 1985, då möss injicerades med polyklonalt anti-NF-kaninserum, vilket förhindrade utvecklingen av dödlig levertoxicitet inducerad av LPS-administrering. Liknande resultat erhölls hos apor: babianer injicerade med en monoklonal musantikropp mot human TNF överlevde efter en intravenös injektion av en dödlig dos av E. coli [104].
Den första terapeutiska TNF-blockeraren utvecklades från en monoklonal musantikropp A2 med hög affinitet härledd från möss immuniserade med human TNFa. Eftersom antikroppar från andra arter har signifikanta skillnader i aminosyrasekvens är de olämpliga för långvarig terapeutisk användning hos människor. Genom genteknik ersattes därför musens konstanta domäner i de tunga och lätta kedjorna med mänskliga. De variabla regionerna som binder antigenet förblev oförändrade. Sådana antikroppar kallas chimära. Därefter fick denna första terapeutiska anti-TNF-antikropp ett internationellt icke-proprietärt namn - infliximab.
En av de mest uppenbara tillämpningarna av antiNF-terapi har varit vid behandling av sepsis. Kliniska studier har dock inte visat signifikanta resultat, vilket tydligen beror på det faktum att när den kliniska bilden av sepsis utvecklas, pågår irreversibla signalkaskader redan.
Vid denna tidpunkt hade många fakta redan ackumulerats som indikerar inblandning av TNF i patogenesen av reumatoid artrit, så denna sjukdom valdes som nästa potentiella mål för antiNF-terapi. Pilotstudier av infliximab vid reumatoid artrit har visat lovande resultat, och ytterligare randomiserade, dubbelblinda studier har bekräftat effekten av antiNF-terapi vid behandling av autoimmuna sjukdomar. Men efter upprepade injektioner utvecklade vissa patienter antikroppar specifika för musaminosyrasekvenser i de variabla domänerna, vilket minskade behandlingens effektivitet.
En dubbelblind, randomiserad studie visade att infliximab har en synergistisk effekt med låga doser metotrexat, ett cellgifter som används för monoterapi vid RA. I kombination är dessa två läkemedel mer effektiva och immunogeniciteten av infliximab minskar. Efterföljande kliniska fas II/III-prövningar ledde till godkännandet av infliximab för behandling av RA.
Verkningsmekanismen för infliximab beror huvudsakligen på bindningen av löslig TNF i den systemiska cirkulationen och på platser med lokalt hyperexpression (synovialhåla vid RA). Men dessutom kan infliximab binda till den transmembrana formen av TNF och orsaka lys av celler som bär det på sin yta genom mekanismen av antikroppsberoende cytotoxicitet.
AntiNF-terapi bryter den patologiska signalkaskaden och leder till en minskning av det inflammatoriska svaret, men dessutom kan den balansera det oreglerade immunförsvaret. Mot bakgrund av introduktionen av TNF-hämmare ändras balansen mellan T-effektor och T-regulatoriska celler.
AntiNF-terapi är inte en etiotrop terapi och bör teoretiskt användas under hela patientens liv, men i vissa fall är det möjligt att uppnå en stabil remission, som kvarstår även efter att antiNF-behandlingen avbrutits.
TNF-blockerare har visat sin effektivitet vid behandling av andra autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar: det har visat sig att TNF spelar en betydande roll i patogenesen av Crohns sjukdom - det överuttrycks i inflammerade delar av tarmen. Preliminära framgångar vid behandling av refraktär Crohns sjukdom med infliximab bekräftades senare i randomiserade kliniska prövningar, vilket ledde till godkännandet av infliximab även för denna sjukdom.
Patogenesen av ankyloserande spondylit (Bekhterevs sjukdom), en annan kronisk systemisk autoimmun sjukdom med dominerande ledinblandning, beror också på TNF-överuttryck. Kliniska prövningar av infliximab har också varit framgångsrika för denna sjukdom. Dessutom har antiNF-terapi visat hög effekt vid behandling av psoriasis och psoriasisartrit.
Hittills har infliximab och andra TNF-blockerare godkänts som terapeutiska medel för följande autoimmuna sjukdomar: reumatoid artrit, juvenil idiopatisk artrit, ankyloserande spondylit, Crohns sjukdom, ulcerös kolit, psoriasis, psoriasisartrit. Dessutom har TNF-antagonister visat positiva resultat vid behandling av sarkoidos, Wegeners granulomatosis, Behçets sjukdom och andra kroniska sjukdomar.
Indikationer på att TNF spelar en roll i patogenesen av multipel skleros har stötts av laboratoriedjurförsök. Införandet av TNF förvärrade symptomen på experimentell autoimmun encefalomyelit hos råttor, och införandet av antiNF-antikroppar förhindrade utvecklingen av denna sjukdom.
Kliniska prövningar av multipel skleros med infliximab och en annan TNF-blockerare, lenercept (löslig TNFR1), gav dock inget signifikant kliniskt svar. Dessutom hos vissa patienter
En modell för autoimmun sjukdom vars patogenes liknar den för multipel skleros. det var en ökning kliniska symtom sjukdomar och en ökning av cellularitet och nivån av immunglobuliner i cerebrospinalvätskan, en ökning av antalet foci vid magnetisk resonanstomografi.
Framgången med infliximab har gett impulser till utvecklingen av nya molekyler som kan blockera signaltransduktion genom TNFR. Dessutom orsakade murina sekvenser i de variabla domänerna av de tunga och lätta kedjorna av infliximab produktionen av sekundära antikroppar hos vissa patienter, vilket blockerade verkan av infliximab och gjorde patienterna motståndskraftiga mot terapi. För att övervinna denna begränsning valdes en väg för att skapa inhibitorer med helt humana aminosyrasekvenser.
Hittills har fyra TNF-antagonister, förutom infliximab, godkänts för klinisk användning (se figur 2):
Etanercept är en rekombinant TNF-hämmare konstruerad av lösligt TNFR2. Dess utveckling baserades på data om att en löslig form av den andra TNF-receptorn finns i människokroppen. Avskalad av metalloproteaser är TNFR2 en ytterligare länk i regleringen av TNF-aktivitet. Etanercept är en dimer av den extracellulära delen av TNFR2 genetiskt sammansmält med Fc-fragmentet av IgG1-immunoglobulin. Bindning till den konstanta regionen av en antikropp ökar signifikant läkemedlets systemiska halveringstid genom att återvinna proteinet genom FcRn-receptorn. Fusionsproteinets neutraliserande aktivitet påvisades i både in vitro och in vivo experiment och bekräftades senare i kliniska prövningar på patienter med reumatoid artrit.
Men vid behandling av inflammatorisk tarmsjukdom har etanercept, till skillnad från infliximab, inte visat terapeutisk effekt. En experimentell TNF-blockerare, onercept, baserad på en annan TNF-receptor, TNFR1 (p55), trots uppmuntrande kliniska pilotstudier i en randomiserad, placebokontrollerad, dubbelblind studie, visade inte heller någon effekt vid behandling av Crohns sjukdom. En in vitro-studie som undersökte T-lymfocyter från lamina propria hos patienter med Crohns sjukdom visade att medan både infliximab och etanercept blockerar TNF, binder endast infliximab till T-celler i lesionen och inducerar apoptos i dem. Detta kan förklara skillnaden i effekt av antikroppsbaserade och rekombinanta receptorbaserade blockerare vid inflammatorisk tarmsjukdom.
Studie av interaktionen mellan Vhh41 och mänsklig TNF genom ytplasmaresonans
Den genetiska konstruktionen som kodar för den bispecifika A9-antikroppen sattes samman genom en 4-primer GAP-reaktion liknande den som beskrivs ovan för ahT-4 enkelkedjiga antikroppsgenen. Den resulterande sekvensen bestod av: antiNF-antikroppsgenen med en domän, sedan sekvensen som kodar för (Gly4Ser)3-artlinkern, och enkelkedjig anti-P4/80-antikroppsgenen (med tillstånd av S. Gordon och M. Stacey). Restriktionsigenkänningsställen Ncol och Xhol inkluderades i sekvensen av framåtriktade respektive omvända primrar. Efter restriktions-PCR-produkt och kloning av den in i expressionsvektorn pET-28b (Novagen), var sekvensen som kodar för polyhexidintaggen i 3-änden i samma läsram. För att erhålla kontrollantikroppen wA9 syntetiserades den mutanta anti-G4/80 scFv-genen innehållande glycin-serin-insert istället för CDR-sekvenser de-novo (Geneart, Tyskland) och klonades istället för den nativa anti-F4/80-genen (se fig. 31B).
Expressionsvektorer som bär inlägg som kodar för A9 och shA9 användes för att transformera E. coli-celler från Rosetta2(DE3)pLysS-stammen (Novagen). De bästa producerande klonerna selekterades genom koloniimmunoblotting med användning av nickelkonjugerat peroxidas (Pierce, 15165). Bakteriekulturer odlades i LB-medium innehållande 50 cg/ml karbenicillin (Sigma-C1389) och 50 cg/ml kloramfenikol (Sigma-C1863) till den logaritmiska fasen, och sedan inducerades expression med 0,2 mM IPTG. Efter 4 timmar utsattes kulturerna för centrifugering vid 3200 g under 30 minuter. Pelletarna frystes och återsuspenderades sedan i lysbuffert (50 mM TrisHCl, 300 MMNaCl, 5 % glycerol, 0,5 % Triton X-100 detergent, 10 000 U/ml lysozym, 10 mM P-merkaptoetanol) och sönderdelades sedan med en ultraljudshomogenisator. Lysaten centrifugerades vid 17000 g under 40 minuter, supernatanterna samlades upp och filtrerades genom ett filter med en pordiameter av 0,22 cm. Bispecifika antikroppar A9 och tA9 renades från klarnade supernatanter på en kromatografisk kolonn innehållande agaros konjugerad med Ni-nitriloättiksyra (Invitrogen R90115). Affinitetskromatografi utfördes enligt tillverkarens protokoll. Det resulterande eluatet koncentrerades, dialyserades mot fosfatbuffrad saltlösning, följt av filtrering genom ett 0,22 μm filter. Proteinkoncentrationen i lösningen mättes med användning av reaktionen med 2,2-bicinchoninsyra (PIERCE 23225 kit) enligt tillverkarens protokoll. Homogeniteten hos det resulterande preparatet testades genom elektrofores i 15 % polyakrylamidgel i närvaro av natriumdodecylsulfat, följt av Coomassie-färgning.
Interaktion av A9- och rA9-antikroppar med rekombinant human TNF genom ytplasmonresonans.
Jämförelse av affiniteterna och kinetiken för interaktionen av A9- och mA9-antikroppar med rekombinant human TNF utfördes på ett ProteOn XPR36-instrument (Bio-Rad). Under loppet av att mäta alla interaktioner användes en fosfatbuffrad saltlösning pH = 7,4, till vilken Tween 20 tvättmedel tillsattes till en koncentration av 0,005 %, yttemperaturen på chipet var 25 C. Rekombinant human TNF uttrycktes i E coli enligt den tidigare beskrivna metoden. Antikropparna A9 och tA9 vid en koncentration av 50 nM immobiliserades genom aminogruppen på ytan av ett biochip med en modifierad alginatpolymeryta (Bio-Rad 176-5011). Sedan applicerades analyten (human TNF) i fem dubbelt minskande koncentrationer (50-3 nM) på fem parallella kanaler. Bufferten som inte innehöll några antikroppar infördes i den sjätte kanalen för normalisering. Analysen av de mottagna sensogrammen utfördes i programmet ProteOn Manager (Bio-Rad) med användning av Langmuir-modellen.
I experiment med peritoneala makrofager isolerades peritoneala kavitetsceller från vildtypsmöss (C57BL/6) och färgades omedelbart med fluorokrom-kojugerade antikroppar. För att få benmärgsmakrofager Benmärg isolerades, varefter cellerna odlades under 10 dagar i ett konditionerat medium (erhållet på linje L929), därefter avlägsnades cellerna från plasten med iskall fosfatbuffert.
Före färgning blockerades Fc-gamma-receptorn, sedan inkuberades cellerna med A9- eller tA9-antikroppar eller buffert, varefter cellerna tvättades och färgades på ett av tre sätt: 1) polyklonala kaninantikroppar mot hTNF-VnH, sedan med sekundära antikroppar mot kanin-IgG konjugerad med fluorokrom. 2) monoklonala musantikroppar mot hexahistidinsekvensen (Novagen - 70796), sedan med sekundära antikroppar mot mus-IgG konjugerad med fluorokrom. 3) rekombinant human TNF tillsattes till cellerna, följt av monoklonala antiNF-antikroppar (Miltenyi Biotec - klon: cA2) märkta med fluorokrom.
Dessutom färgades celler med anti-P4/80 och anti-CD 1 lb antikroppar konjugerade till fluorokromer. Prover analyserades på antingen F ACS Aria (BDBiosciences) eller Guava EasyCyte 8HT (Millipore) och bearbetades sedan med FlowJo-mjukvara (Treestar Inc.).
Utvärdering av förmågan hos den bispecifika A9-antikroppen att kvarhålla human TNF på ytan av makrofager.
Peritoneala makrofager från möss som producerade human TNF isolerades och såddes med 100 000 celler per brunn i odlingsplattor med 96 brunnar. Celler inkuberades i 2 timmar vid 37°C, 5% CO2, varefter icke-fästa celler tvättades bort med varm fosfatbuffert. Cellerna inkuberades sedan över natten vid 37°C, 5% CO2. Efter tvätt med 200 μl varmt DMEM-medium inkuberades cellerna med A9-antikroppar i en koncentration av 2 μg/ml eller med DMEM-medium i 30 minuter vid 37°C. Efter ytterligare en tvätt stimulerades cellerna med LPS (Sigma, L2630) vid en koncentration av 100 ng/ml. Efter 4 timmar samlades odlingssupernatanter och human TNF-koncentration mättes med användning av ett ELISA-kit (eBioscience, 88-7346) enligt tillverkarens protokoll.
Benmärg från möss som producerade human TNF isolerades, varefter cellerna odlades under 10 dagar i ett konditionerat medium (erhållet på linje L929), sedan avlägsnades cellerna från plasten med iskall fosfatbuffert. Antalet levande celler räknades och de placerades på plattor med 96 brunnar i en koncentration av 50 000 celler/brunn. Sedan tillsattes 250 uM A9-antikropp eller hTNF-VffH enkeldomänantikropp eller blankmedium (DMEM) till cellerna. Celler inkuberades med antikroppar under 30 min. Brunnarna tvättades sedan med fosfatbuffrad saltlösning. Därefter stimulerades TNF-produktion av LPS (Sigma - L2630) vid en koncentration av 100 ng/ml. Efter 4 timmar samlades supernatanterna upp, koncentrationen av TNF i dem mättes med användning av ett cytotoxiskt test på linjen av musfibrosarkom L929 enligt protokollet liknande det som beskrivits ovan.
Studie av de biologiska egenskaperna hos den fluorescerande sensorn Vhh41-KTNFin vitro och in vivo
Baserat på experimentella data som erhållits på muslinjer där Tnf-genen är raderad i separata cellpopulationer, formulerades en hypotes om möjliga olika funktioner hos TNF som produceras av olika typer av immunocyter. Således visades det nyligen att TNF producerad av T-lymfocyter, men inte av myeloidceller, har en unik skyddande funktion i en modell av experimentell tuberkulosinfektion. Dessutom har data erhållits i vårt laboratorium som indikerar de patogena egenskaperna hos TNF från myeloidceller vid autoimmuna sjukdomar. Den terapeutiskt applicerade fullständiga blockeringen av PMB tar inte hänsyn till dessa egenskaper. Som en del av utvecklingen av denna hypotes valdes specifik hämning av TNF producerad av celler i monocyt-makrofagerserien, vilket skulle kunna ha en betydande fördel jämfört med den systemiska blockeringen av denna cytokin. I synnerhet kan en intakt signal från TNF producerad av B- och T-lymfocyter minska förekomsten av biverkningar, och dessutom göra antiNF-terapi effektiv vid de sjukdomar för vilka TNF-blockerare inte tidigare har visat klinisk effekt, eller till och med orsakat en ökning av symtomen. Dessutom kan detta tillvägagångssätt potentiellt minska den erforderliga dosen genom riktad leverans till producentceller.
För att testa detta antagande konstruerade och testade vi en bispecifik antikropp som binder till en del av makrofagytan på grund av interaktion med F4/80-transmembranmolekylen, och med den andra specificiteten fångar och blockerar TNF som produceras av dem.
Molekylär kloning, uttryck och rening av bispecifika antikroppar. Den bispecifika antikroppen, en selektiv blockerare av makrofag-TNF, benämndes A9. En enkeldomänblockerande antiNF-antikropp hTNF-VffH och en enkelkedjig antikropp (scFv) mot makrofagytmarkör F4/80 (vänligen tillhandahållen av S. Gordon (Oxford University, Storbritannien) och M. Stacy (University of Leeds, Storbritannien) användes för att skapa en genetisk konstruktion som kodar för den. Sekvenserna som kodar för båda antikropparna amplifierades genom polymeraskedjereaktion (PCR) och klonades in i en expressionsvektor så att de var i samma läsram och en nukleotidsekvens som kodade för en flexibel glycin-serin länk (GSGGGGSG) bildades mellan dem Sekvensen som kodar för histidinhexameren är belägen vid C-terminalen av sekvensen för efterföljande rening av proteinet (fig. 31).
Utformningen av den bispecifika A9-antikroppen, en schematisk representation av dess verkningsmekanism, strukturen av de genetiska konstruktionerna som kodar för den bispecifika A9-antikroppen och den systemiska TNF-kontrollblockeraren, tA9-antikroppen. (A) Den bispecifika A9-antikroppen består av en enkeldomänantikropp (VHH) mot human TNF och en enkelkedjig antikropp (scFv) mot ytmolekylen F4/80 uttryckt på monocyter och makrofager. (B) Principen för selektiv blockering av TNF som produceras av makrofager: A9 binder till ytan av makrofager och fångar upp TNF som frigörs från deras yta, vilket hindrar det från att komma in i den systemiska cirkulationen. (B) Diagram över den genetiska konstruktionen av den bispecifika A9-antikroppen och den systemiska TNF-kontrollblockeraren, tA9. AntiNF-antikroppsgenen med en enkel domän följs av en sekvens som kodar för en flexibel glycin-serinlinker och sedan en enkelkedjig anti-F4/80-antikroppsgen. Detta följs av en sekvens som kodar för en histidinhexamer för affinitetsrening. Kontroll-tA9-antikroppen har en liknande sekvens, förutom att de 6 hypervariabla regionerna av anti-P4/80-antikroppen ersätts med sekvenser av typen (Gly3Ser)n, vilket förhindrar antikroppen från att binda till makrofagernas yta och omvandlar den till en systemisk TNF-hämmare.
För att studera effekterna av specifik blockering av TNF producerad av makrofager behövdes en systemisk kontrollblockerare. För att undvika effekterna associerade med skillnader i antikroppsaffinitet, beslutades det att använda en blockerare med ett liknande A9 TNF-bindningsställe. Och för att utesluta påverkan av andra faktorer, i synnerhet den isoelektriska punkten och molekylvikten, som kan påverka halveringstiden, bör kontrollantikroppen vara så nära den som studeras i den primära aminosyrasekvensen som möjligt. Därför konstruerade vi en kontrollantikropp - tA9, som har samma struktur och aminosyrasekvens som A9, förutom att 6 av dess hypervariabla regioner i anti-P4/80 scFv ersattes av sekvenser av typen (Gly3Ser)n, samma längd som ursprungliga CDR-regioner (se fig. 31B).
Båda antikropparna uttrycktes i bakteriesystemet och renades genom affinitetskromatografi.
Storleken på A9-antikroppen, bestämd genom elektroforetisk mobilitet och HPLC-data, motsvarade den beräknade molekylvikten på 45 kDa (Fig. 32). kromatografi. Till vänster - värdena för proteiners molekylvikt. (B) Kromatogram av den bispecifika A9-antikroppen (markerad i rött) ovanpå kromatogrammet av molekylviktsmarkörer. (B) Funktion av transittid för en molekyl som en funktion av molekylvikten. Den beräknade molekylvikten för den bispecifika A9-antikroppen var 43,4 kDa.
Interaktion av A9- och tA9-antikroppar med rekombinant human TNF. Interaktionskinetiken för A9- och mA9-antikroppar med rekombinant human TNF mättes genom ytplasmonresonans. För att göra detta immobiliserades båda antikropparna i en koncentration av 50 nM på ytan av sensorchippet, varefter rekombinant human TNF i serieutspädningar på 50-3 nM applicerades som en analyt och interaktionskinetiken mättes på en ProteOn XPR36 instrument. Båda antikropparna visade hög affinitet: Kd för A9 och tA9 var 85 respektive 95 pM. Detta bekräftar att de införda mutationerna inte påverkade TNF-bindning. Dessutom hade båda antikropparna liknande parametrar för bindningshastighet (Kforward, on-rate) och dissociationshastighet (Kreverse, off-rate) - som visas i fig. 33 och i Tab. 3. Den långsamma dissociationshastigheten bör tillåta A9-antikroppen att behålla bunden TNF.
Produktion och karakterisering av en ny rekombinant enkeldomänantikropp som specifikt binder till human TNF, men som inte blockerar dess biologiska aktivitet
Interaktionskinetiken för A9- och mA9-antikroppar med rekombinant human TNF mättes genom ytplasmonresonans. För att göra detta immobiliserades båda antikropparna i en koncentration av 50 nM på ytan av sensorchippet, varefter rekombinant human TNF i serieutspädningar på 50-3 nM applicerades som en analyt och interaktionskinetiken mättes på en ProteOn XPR36 instrument. Båda antikropparna visade hög affinitet: Kd för A9 och tA9 var 85 respektive 95 pM. Detta bekräftar att de införda mutationerna inte påverkade TNF-bindning. Dessutom hade båda antikropparna liknande parametrar för bindningshastighet (Kforward, on-rate) och dissociationshastighet (Kreverse, off-rate) - som visas i fig. 33 och i Tab. 3. Den långsamma dissociationshastigheten bör tillåta A9-antikroppen att behålla bunden TNF.
Kinetik för interaktionen mellan den bispecifika antikroppen A9 och kontrollantikroppen tA9 med rekombinant human TNF. (A) Interaktionskurvor (sensogram) för rekombinant human TNF vid koncentrationer av 50 nM - 3 nM med ett sensorchip på vilket den bispecifika A9-antikroppen och kontroll-tA9-antikroppen immobiliserades visas. Abskissan visar tiden i sekunder, ordinatan visar resonansvinkelförskjutningen i konventionella enheter (AU). (B) För varje grupp av sensogram beräknades bindningshastigheten (op-rate), dissociationshastigheten (off-rate) och dissociationskonstanten (Kd). De resulterande medelvärdena såväl som standardavvikelsen (SD) plottas på ett isoaffinitetsdiagram. De diagonala linjerna motsvarar de angivna värdena för dissociationskonstanten.
För att utvärdera den relativa aktiviteten av A9-antikroppen för att hämma de biologiska effekterna av TNF, utfördes ett cytotoxiskt test på L929 musfibrosarkomlinjen. Serieutspädningar av A9- och mA9-antikroppar tillsattes till konstanta koncentrationer av rekombinant human TNF och aktinomycin-D. Enligt erhållna data har antikropparna A9 och rA9 liknande antiNF-aktivitet (Fig. 34 A). Dessutom bekräftades det att aktiviteten hos den bispecifika antikroppen A9 motsvarar aktiviteten hos enkeldomän-anti-NF-antikroppen hTNF-VffH, som är en del av A9 och mA9 (Fig. 34 B). 10 10 10
AntiNF-aktivitet av den bispecifika A9-antikroppen, mA9-kontrollantikroppen och hTNF-VffH enkeldomänantikropp. (A) Jämförelse av aktiviteten hos den bispecifika A9-antikroppen och kontroll-tA9-antikroppen. Överlevnadskurvan för L929 musfibrosarkomceller under samtidig exponering för en konstant dos av human TNF och minskande doser av antikropparna A9 och tA9 visas. (B) Jämförelse av aktiviteten av den bispecifika A9-antikroppen och hTNF-VnH-enkeldomänantikroppen. Överlevnadskurvan för L929 musfibrosarkomceller visas under samtidig exponering för en konstant dos av human TNF och minskande doser av antikropparna A9 och hTNF-VHH Jämförelsen utfördes i molära koncentrationer för att utesluta effekterna av skillnader i molär massa på aktiviteten hos antikroppen som ska bestämmas.
Analys av bindningen av antikropparna A9 och mA9 till makrofagernas yta genom interaktion med ytmolekylen F4/80.
Förmågan hos den bispecifika A9-antikroppen att specifikt binda till makrofagernas yta bedömdes med flödescytometri. För detta inkuberades celler isolerade från peritonealhålan med A9-antikroppar, varefter de färgades för makrofagmarkörerna CD1 lb och F4/80, och samtidigt utfördes specifik färgning för den bispecifika A9-antikroppen genom antikroppar mot VHH ELLER antikroppar mot polyhistidinmärkningen. Proverna utsattes sedan för flödescytometri och analys.
Dessa experiment visade att den bispecifika A9-antikroppen kunde binda till ytan av peritoneala celler som uttrycker F4/80 och CD1 lb på deras yta (monocyter och makrofager) (Fig. 35 A - D). Samtidigt binder A9 inte till celler i peritonealhålan som inte har dessa markörer (främst lymfocyter) (Fig. 35 E och F). Minskningen av nivån av parallell anti-F4/80-färgning med tillsats av A9-antikroppen på grund av konkurrensen mellan två antikroppar för bindning till målet bekräftar att A9 specifikt interagerar med denna speciella molekyl på cellytan (Fig. 35 G) och 3).
Namnet Mac-1 används också. En beståndsdel av C3-receptorkomponenten i komplementsystemet. Hos möss uttrycks det på monocyter, makrofager och mikrogliaceller. bispecifik antikropp
Celler i peritonealhålan inkuberades med eller utan den bispecifika A9-antikroppen (visad i rött) eller utan den (visad i blått), och färgades sedan med fluorescensmärkta antikroppar mot ytmarkörer specifika för monocyt-makrofagceller, såväl som antikroppar specifika för A9. Därefter analyserades de erhållna proverna med flödescytometri. (A, C, E, G) färgning genom antikroppar mot VHH-domänen. (B, D, F, 3) färgning genom antikroppar mot polyhexidinsekvensen. (A, B) A9 bispecifik antikropp binder till celler som väljs för högt uttryck av F4/80 och CD1 lb (makrofager). På det visade histogrammet visar den horisontella axeln fluorescensvärdet i färgningskanalen vid A9, den vertikala axeln visar den normaliserade frekvensen av händelsen. (C, D) samma i form av ett spridningshistogram. Den horisontella axeln visar fluorescensvärdet i färgningskanalen vid A9, den vertikala axeln visar fluorescensvärdet i färgningskanalen vid F4/80. (E, E)-bispecifik antikropp A9 binder inte till celler i peritonealhålan som inte uttrycker F4/80 och CD1 lb (lymfocyter). På det visade histogrammet visar den horisontella axeln fluorescensvärdet i färgningskanalen vid A9, den vertikala axeln visar den normaliserade frekvensen av händelsen. (G, 3) - inkubation med A9 bispecifik antikropp minskar färgningsintensiteten med F4/80. På det avbildade histogrammet visar den horisontella axeln fluorescensvärdet i färgningskanalen vid F4/80, den vertikala axeln visar den normaliserade frekvensen av händelsen.
Benmärgsmakrofager inkuberades med A9 bispecifik antikropp (visad i rött), utan den (visad i blått), eller med kontroll tA9 antikropp (visad i svart) och färgades sedan med antikroppar specifika för A9/mA9. De erhållna proverna analyserades med flödescytometri. (A) Den bispecifika A9-antikroppen binder specifikt till benmärgsmakrofager. På det visade histogrammet visar den horisontella axeln fluorescensvärdet i färgningskanalen vid A9, den vertikala axeln visar den normaliserade frekvensen av händelsen. (B) mA9-kontrollantikroppen kan inte binda till benmärgsmakrofager. På det visade histogrammet visar den horisontella axeln värdet av fluorescens i färgningskanalen på wA9, den vertikala axeln visar den normaliserade frekvensen av händelsen.
Dessutom visades det i ytterligare cytofluorometriska experiment att A9-antikroppen, när den är fäst vid ytan av makrofager, kan samtidigt binda exogent tillsatt human TNF (Fig. 37). Detta bekräftar att båda underenheterna av den bispecifika antikroppen är funktionellt aktiva samtidigt, och att bindning av de två antigenerna samtidigt är steriskt möjlig.
Celler i peritonealhålan inkuberades med eller utan A9 bispecifik antikropp (visad i rött) eller utan den (visad i blått), sedan med rekombinant human TNF, varefter de färgades med fluorescensmärkta antikroppar mot ytmarkörer specifika för monocyt-makrofager celler, såväl som antikroppar specifika för human TNF. De erhållna proverna analyserades med flödescytometri. (A) A9 bispecifik antikropp med förmåga att behålla human TNF på ytan av makrofager (celler selekterade för högt uttryck av F4/80 och CD1 lb). På det visade histogrammet visar den horisontella axeln fluorescensvärdet i TNF-färgningskanalen, den vertikala axeln visar den normaliserade frekvensen av händelsen. (B) Samma data i form av spridningshistogram. Den horisontella axeln visar fluorescensvärdena i TNF-färgningskanalen, den vertikala axeln visar fluorescensvärdena i F4/80-färgningskanalen.
Metoder för genteknik, i synnerhet kloning av individuella gener eller deras delar, såväl som DNA-sekvensering, har gjort det möjligt att avsevärt förbättra metodiken för mutagenes, vilket eliminerar de största nackdelarna med klassiska metoder för att inducera mutationer i genom. Klassisk genetisk analys antar effekten av en mutagen faktor in vivo på hela genomet, vilket resulterar i slumpmässiga mutationer, ofta flera, vilket i hög grad komplicerar identifieringen av mutanter. Detekteringen av mutanter utförs av förändrade fenotypiska egenskaper och mutationens natur kan bestämmas efter DNA-sekvensering. Modern lokal mutagenes involverar i själva verket de omvända åtgärderna: först klonas genen eller dess intressanta segment, dess struktur bestäms under sekvensering och sedan görs de nödvändiga förändringarna in vitro i dess sammansättning. Konsekvenserna av den inducerade mutationen bestäms efter införandet av den muterade genen i den ursprungliga organismen.
Den enklaste varianten av lokaliserad mutagenes är behandlingen av ett klonat DNA-fragment med en av de mutagena faktorerna, men sådan exponering kommer också att resultera i slumpmässiga förändringar i fragmentets struktur. Mer tillförlitliga och mer vanligt använda metoder för lokaliserad mutagenes utförs utan användning av mutagena faktorer. Bland typerna av mutationer dominerar deletioner, insertioner och nukleotidsubstitutioner.
Borttagningar. Dessa typer av mutationer produceras av endonukleaser genom lokaliserad mutagenes. Både restriktiva och icke-specifika endonukleaser används. Den enklaste användningen av restriktionsenzymer är att klyva ett genom med ett restriktionsenzym som introducerar flera avbrott med bildandet av klibbiga ändar. De resulterande fragmenten sluts återigen i en ring med hjälp av DNA-ligas, vilket kan leda till bildning av molekyler som inte innehåller ett av DNA-segmenten. Detta tillvägagångssätt ger stora deletioner och används i allmänhet i preliminära experiment för att bestämma funktionerna hos relativt stora delar av klonat DNA.
Små deletioner erhålls enligt följande. Det klonade fragmentet digereras i vektorn på lämplig plats med ett restriktionsenzym (Fig. 21.1). Den resulterande linjära molekylen behandlas med exonukleas III, som hydrolyserar en sträng i DNA:t,
från 3'-änden. Resultatet är en uppsättning molekyler med enkelsträngade 5'-svansar av olika längd. Dessa svansar hydrolyseras av enkelsträngat DNA-specifikt S1-nukleas, och deletioner bildas i DNA:t. Du kan också använda exonukleas Bal 31, som katalyserar nedbrytningen av båda strängarna, med början från ändarna av linjära DNA-molekyler. Förloppet av nukleotiska reaktioner regleras genom att variera inkubationstiden, temperaturen och enzymkoncentrationen, vilket inducerar bildandet av deletioner av olika längd. De resulterande linjära DNA-deletionsvarianterna förses ofta med linkers före cyklisering så att restriktionsställen är närvarande i området för deletionen. Det finns andra modifieringar av de beskrivna metoderna.
Insatser (inlägg). För att erhålla insättningar digereras det klonade DNA:t med ett restriktionsenzym eller ett icke-specifikt endonukleas, och sedan ligeras de resulterande fragmenten i närvaro av segmentet som ska infogas i DNA:t. Oftast används kemiskt syntetiserade polylinkers som sådana segment (kapitel 20).
Insertioner, som deletioner, kan störa integriteten hos genen eller strukturen av dess regulatoriska regioner, vilket resulterar i syntesen av ett defekt protein (vid förlängda deletioner eller en ramförskjutning, vanligtvis inaktiv) eller förändringar i transkriptionsprocessen av gen av intresse. Regulatoriska mutanter erhålls ofta på detta sätt och uttryckta vektorer konstrueras (kapitel 20).
Punktmutationer . Dessa mutationer är nukleotidsubstitutioner. Flera metoder kan användas för att erhålla dem: cytosin-deaminering, inkludering av nukleotidanaloger, felaktig inkludering av nukleotider under gapreparation, etc.
Den första metoden bygger på det faktum att cytosinrester i enkelsträngat DNA kan deamineras för att bilda uracil genom behandling med bisulfitjoner. Enkelsträngade regioner i DNA erhålls vanligtvis nära restriktionsställen, till exempel genom verkan av exonukleas III. Efter behandling med bisulfit fylls de enkelsträngade luckorna med DNA-polymeras och ändarna ligeras. På platser där uridylat bildades istället för cytidylat under deaminering, kommer adenylat att ta den komplementära positionen, och under replikeringen av en sådan molekyl kommer GC-paret att ersättas av AT-paret.
Ett annat tillvägagångssätt för induktion av substitutioner är att behandla klonat DNA med något restriktionsenzym i närvaro av etidiumbromid, som sätts in mellan basparplanen och introducerar störningar i duplexstrukturen. Som ett resultat bildas endast ett enkelsträngat DNA-brott. Ett litet gap skapas vid enkelsträngsbrottet och byggs sedan upp i närvaro av DNA-polymeras, dATP, dGTP, dCTP och N-4-hydroxicytosintrifosfat istället för dTTP. Hydroxycytosintrifosfat ingår i kedjan istället för tymidylat, men under DNA-replikation paras det lika bra med både adenylat och guanylat. Som ett resultat av inkorporeringen av guanylat, efter en ytterligare replikeringsrunda, kommer AT → GC-substitution att ske på denna plats (Fig. 21.2). Eftersom i denna metod utförs nukleotidersättning inuti
restriktionsställe blir det möjligt att enkelt skilja mellan vektorer med den ursprungliga sekvensen och muterade. För att göra detta räcker det att behandla dem med restriktionsenzymet som används i experimentet: mutantmolekylerna kommer inte att genomgå klyvning.
En liknande metod är baserad på användningen av endast tre av de fyra möjliga nukleotiderna när man fyller ett enkelsträngat gap med DNA-polymeras. I de flesta fall stannar enzymet vid platsen för molekylen där det möter en komplementär nukleotid till den saknade. Emellertid gör DNA-polymeraset ibland ett misstag och inkluderar en av de tre närvarande nukleotiderna. Detta leder till bildandet av ringmolekyler, som innehåller oparade icke-komplementära kvävebaser. När sådana vektorer introduceras i bakterieceller kommer några av molekylerna att reparera sådana skador. Som ett resultat kommer den ursprungliga sekvensen att återställas i hälften av molekylerna efter replikering, och mutationen fixeras i den andra hälften. Mutantmolekyler kan särskiljas med metoden som beskrivs ovan.
Platsspecifik mutagenes. De lokaliserade mutagenesmetoderna kännetecknas av att de platser där mutationer uppträder väljs slumpmässigt. Samtidigt gör tekniken för platsspecifik mutagenes det möjligt att introducera mutationer i en exakt definierad region av en gen. Detta utförs med användning av syntetiska (erhållna genom kemisk syntes) oligonukleotider med en given sekvens. Metoden är bekväm genom att den inte kräver närvaron av lämpliga restriktionsställen. Metoden bygger på bildandet av heteroduplex mellan en syntetisk oligonukleotid innehållande en mutation och komplementärt enkelsträngat DNA i vektorn.
Fortsätt enligt följande. En liten oligonukleotid (8-20 monomerer) syntetiseras som är komplementär till den del av genen där de vill få en mutation. Som en del av oligonukleotiden centrala regionen tillåta en eller flera nukleotidsubstitutioner. Den undersökta genen eller dess fragment klonas i vektorn baserad på M13-fagen för att erhålla cirkulärt enkelsträngat rekombinant DNA. Producera blandning och hybridisering av rekombinanta vektorer med oligonukleotider. Oligonukleotiden hybridiserar med den komplementära regionen, medan icke-komplementära nukleotider förblir oparade. Oligonukleotiden fungerar som en primer i polymerasreaktionen som involverar DNA-polymeras in vitro. Ringen är stängd med ligaser. Den resulterande cirkulära molekylen introduceras i E. coli-celler, där partiell reparation av mutantreplikationsställen sker. Mutationsfrekvensen varierar vanligtvis från 1 till 50 %. Urvalet av celler innehållande mutanta DNA-molekyler kan utföras på flera sätt, bland vilka metoden som använder en radioaktivt märkt oligonukleotid, som används för mutagenes, har fördelen. I detta fall fungerar denna nukleotid som en sond. Principen för att använda en sådan prob är baserad på det faktum att den är helt komplementär till mutant DNA och delvis komplementär till vildtyps-DNA. Det är möjligt att välja sådana hybridiseringsbetingelser (först och främst temperatur) att hybridisering av den märkta sonden kommer att vara stabil endast med den muterade DNA-sekvensen, som kan detekteras med radioautograf.
Metoden för platsspecifik mutagenes är särskilt värdefull eftersom den tillåter en att isolera mutationer utan att kontrollera deras fenotypiska manifestation. Denna metod öppnar upp nya möjligheter för att studera funktionerna hos genreglerande element, låter dig ändra "styrkan" hos promotorer, optimera bindningsställen med ribosomer, etc. En av de viktigaste tillämpningarna av denna metod är proteinteknik.
Proteinteknik. Denna fras hänvisar till en uppsättning metodologiska tekniker som tillåter rekonstruktion av en proteinmolekyl genom riktad introduktion av lämpliga mutationer i en strukturell gen (platsspecifik mutagenes) och följaktligen de önskade aminosyrasubstitutionerna i proteinets primära struktur.
Ett illustrativt exempel på konstruktionen av mer aktiva proteiner är Fershts och medarbetares experiment med enzymet tyrosyl-tRNA-syntetas från bakterien Bacillus stearothermophilus. En analys av konsekvenserna av aminosyrasubstitutioner i det aktiva centret av detta enzym ledde till slutsatsen att avlägsnande av grupper som bildar svaga vätebindningar med substratet kan förbättra dess affinitet för substratet. Man fann att treonin-51 (upptar den 51:a positionen i peptiden) bildar en lång och svag vätebindning med syret i ribosringen när tyrosyladenylat binds. Samtidigt fann man att prolin intar samma position i E. coli-bakterier. Platsspecifik mutagenes av genen som bestämmer strukturen hos B.stearothermophilus tyrosyl-tRNA-syntetas gjorde det möjligt att tillhandahålla en ersättning thr-51→pro-51 i en peptid. Som ett resultat förbättrades bindningen av ATP i enzymets aktiva centrum dramatiskt, och dess katalytiska aktivitet ökade 25 gånger.
Ett annat lika signifikant exempel på proteinrekonstruktion av praktisk betydelse är modifieringen av subtilisin från Bacillus amyloliquefaciens, utförd av Estelle et al. Subtilisiner är serinproteinaser som utsöndras av baciller i miljön. Dessa enzymer produceras i stor skala av bioteknikindustrin och används i stor utsträckning i tvättmedelsformuleringar. Nackdelen med subtilisiner är en kraftig minskning av proteolytisk aktivitet under inverkan av oxidationsmedel, inklusive de som finns i tvättpulver. Uppgiften att rekonstruera BPN-subtilisinmolekylen var att stabilisera den mot kemisk oxidation.
I preliminära experiment fann man att i närvaro av väteperoxid minskar subtilisin snabbt aktiviteten på grund av oxidationen av metionin-222-resten, som förvandlas till motsvarande sulfoxid. Metoder för platsspecifik mutagenes säkerställde ersättningen av denna metioninrest med alla de andra 19 proteinaminosyrorna. Plasmider med mutanta gener introducerades i stammar med deletioner i motsvarande gener och egenskaperna hos de producerade subtilisinerna analyserades. Mutanter med serin och alanin visade sig vara tillräckligt stabila för verkan av peroxid222. Mutanten som innehöll cystein-222-resten visade sig vara den mest aktiva, dess specifika aktivitet översteg den för vildtypsstammen med 38 %.
På liknande sätt var det möjligt att öka aktiviteten av b-interferon. Bland andra prestationer inom proteinteknik kan man nämna studier för att belysa onkoproteiners transformerande aktivitet; ändra termostabiliteten hos enzymer, till exempel erhållande av termolabilt renin och termostabilt a-amylas; en ökning av effektiviteten av insulinbindning av motsvarande plasmamembranreceptor på grund av ersättningen av histidin med aspartat vid position 10 i b-kedjan av hormonet, såväl som många andra exempel. Ett stort antal proteintekniska produkter har redan funnit praktiska tillämpningar i tillverkningsprocesser.
I de ovan diskuterade peptidbiblioteken är de senare kovalent kopplade till bärarproteinet. I denna form är de en av representanterna för hybridproteiner erhållna genom genteknik.
I ett annat fall används hybridproteiner för att erhålla hög nivå uttryck av korta peptider i bakterieceller på grund av stabiliseringen av dessa peptider i sammansättningen av hybridproteiner. Fusionsproteiner används ofta för att identifiera och rena svårupptäckta rekombinanta proteiner. Till exempel, genom att fästa -galaktosidas som ett reporterprotein till C-terminalen av proteinet som studeras, är det möjligt att rena det rekombinanta proteinet genom aktiviteten av -galaktosidas, bestämma dess antigena determinanter med immunokemiska metoder. Genom att länka DNA-fragment som innehåller öppna läsramar (ORF) med reporterproteingener är det möjligt att rena sådana fusionsproteiner för reporterproteinaktivitet och använda dem för immunisering av laboratoriedjur. De resulterande antikropparna används sedan för att rena det nativa proteinet, vilket inkluderar den rekombinanta polypeptiden som kodas av ORF, och därigenom identifiera det klonade genfragmentet.
Med hjälp av hybridproteiner löses också det omvända problemet med att klona en okänd gen, till proteinprodukten som det finns antikroppar av. I detta fall konstrueras ett klonbibliotek av nukleotidsekvenser som representerar ORF:er av okända gener i vektorer som tillåter den klonade ORF:en att länkas i samma läsram som reportergenen. Fusionsproteiner som är ett resultat av uttrycket av dessa rekombinanta gener identifieras med användning av antikroppar genom enzymimmunanalyser. Hybridgener som kombinerar utsöndrade proteiner och reporterproteiner gör det möjligt att utforska utsöndringsmekanismerna på ett nytt sätt, såväl som lokaliseringen och rörelsen av utsöndrade proteiner i vävnader.
Hybridgifter
En serie arbeten av I. Pastan och hans medarbetare om utformningen av riktade hybridtoxiner illustrerar perfekt möjligheterna med proteinteknik när det gäller att kombinera olika funktionella domäner av proteiner för att uppnå specifika biologiska effekter.
Ris. II.22. Riktade läkemedel baserade på hybridgifter
a- ett generaliserat schema över strukturen för ett riktat läkemedel; b– strukturen hos det pseudomonadiciska toxinet (siffror anger aminosyraresternas position); i– hybridtoxinets struktur. G– hybridtoxin baserat på monoklonala antikroppar
Ett idealiskt läkemedel med en strikt specifik selektiv verkan bör ha åtminstone följande strukturella och funktionella egenskaper (Fig. II.22, a). Ett sådant läkemedel måste innehålla en aktiv beståndsdel för att uppnå en fysiologisk effekt och en ligand som känner igen en receptor på ytan av målceller. Dessutom måste det innehålla strukturella element som känns igen av kroppens transportsystem för läkemedelsleverans till målceller, samt ett spacerställe som är nödvändigt för att separera den aktiva beståndsdelen från de återstående funktionella delarna av läkemedlet efter leverans till adressen. Det är detta idealiska schema som realiseras i det naturliga exotoxinet av Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa exotoxin A är ett protein som består av en enda polypeptidkedja 613 aminosyror lång, som är organiserad i tre funktionella domäner (se Fig. II.22, b). Den N-terminala domänen Ia (aminosyrarester 1–252) krävs för interaktion med ytan av målceller (en prototypligand för ett idealiskt målinriktat läkemedel). Funktionerna för domän Ib (aminosyrarester 365–404) är för närvarande okända. Domän II (aminosyraresterna 253-364) säkerställer effektiv överföring av toxinet till cellcytosolen (läkemedelstransportsystemet), och domän III (aminosyraresterna 405-613) utför ADP-ribosylering av translationsförlängningsfaktorn EF2, vilket leder till undertryckande av translation och celldödsmål. För att exotoxin A ska ha en cytotoxisk effekt är det alltså nödvändigt att känna igen receptorer på cellytan med hjälp av domän Ia, penetrera in i cellen med hjälp av receptormedierad endocytos och translokeras genom det inre membranet till cytosolen, där EF2-faktorn är lokaliserad. Huvudidén med att skapa riktade toxiner var att ersätta domän Ia med någon annan peptidligand som interagerar med en annan grupp av receptorer på cellytan och därigenom ändra specificiteten för toxinets verkan i förhållande till själva cellerna (se fig. II. 22, i).
Det visade sig att avlägsnandet av domän Ia genom gentekniska metoder dramatiskt (med hundratals och tusentals gånger) minskar toxiciteten hos ett sådant trunkerat protein både i förhållande till celler av olika linjer och in vivo. Bindning till den C-terminala delen av den trunkerade polypeptiden av den humana interleukin 2-molekylen utfördes genom att kombinera de strukturella delarna av motsvarande gener i expressionsvektorn. Det renade hybridtoxinet visade sig vara extremt giftigt för celler som bär interleukin 2-receptorer på sin yta, och verkade inte på celler som saknade dessa receptorer och som dog under verkan av naturligt toxin. Internalisering(translokation in i celler) av hybridtoxinet medierades av p55- och p70-subenheterna av interleukin 2-receptorn. Således, som ett resultat av hybridtoxinets verkan på en population av celler, av vilka några uttrycker interleukin 2-receptorer på deras ytan sker selektiv död av dessa celler.
I kroppen uttrycker de flesta vilande och minnes-T-celler inte interleukin 2-receptorer med hög affinitet på sin yta, medan T-celler stimulerade med alloantigener innehåller sådana receptorer. Därför minskade intraperitoneal administrering av hybridtoxinet till råttor med experimentell artrit, en sjukdom orsakad av patologisk T-cellsaktivering, symtomen på sjukdomen. Hybridtoxinet minskade också signifikant avstötning av transplantat hos möss.
Dessa banbrytande arbeten följdes av en hel serie studier som syftade till att skapa liknande system för riktad leverans av olika cytotoxiska polypeptider. I processen för ytterligare förbättring av systemet för riktad leverans av pseudomonas-toxinet med användning av interleukin 2 som en ligand, övergav de det fullständiga avlägsnandet av måldomänen av toxinet och begränsade det till dess inaktivering genom att introducera fyra platsspecifika mutationer i toxingenen. Molekyler av detta hybridtoxin visade sig vara 10–100 gånger effektivare cytotoxiska medel mot mänskliga och apceller som uttrycker receptorer för interleukin 2 på deras yta, och hade också en signifikant längre halveringstid i blodet hos möss in vivo jämfört med tidigare erhållen konstruktion.
På basis av pseudomonas-toxin skapades hybridtoxiner innehållande polypeptidkedjor av interleukin 4, interleukin 6, transformerande tillväxtfaktor typ och insulinliknande tillväxtfaktor I som ligander. Mycket specifik cytotoxicitet mot tumörceller (inklusive humana myelomceller) visades för alla dessa hybridproteiner.) med motsvarande receptorer. Användningen i hybridtoxinet som en ligand av en del av CD4-polypeptidkedjan, ett T-cellsytglykoprotein, som är receptorn för HIV-viruset och interagerar med dess gp120-glykoprotein, gjorde det möjligt att selektivt infektera infekterade T-celler med HIV-viruset och uttrycker det virala gp120-proteinet på deras yta.
Samma princip för undertryckande av infektion orsakad av HIV-virus av lösliga CD4-receptorer användes vid konstruktionen av hybridproteiner som kombinerar delar av CD4-polypeptidkedjor med konstanta delar av tunga eller lätta kedjor av humana immunglobuliner. Samtidigt, i processen att kombinera gener, avlägsnades nukleotidsekvenserna som kodar för de transmembrana och cytoplasmatiska domänerna av CD4, såväl som den variabla delen av polypeptidkedjorna av immunoglobuliner. De resulterande hybridmolekylerna kallas immunoadhesiner, på grund av den konstanta delen av immunglobulinmolekylen, förvärvade de ökad stabilitet i kroppen och bibehöll dessutom specifika egenskaper medierade av de konstanta delarna av immunglobulinerna: bindning av Fc-receptorn och protein A, förmågan att fixera komplement och överföra genom placentabarriären. Kombinationen av alla dessa egenskaper gjorde det möjligt för immunadhesiner att effektivt avbryta infektionen av T-celler med HIV-I-viruset, blockera både viruset i sig och cellerna som infekterats av det, vilket uttrycker gp120-virusantigenet på deras yta.
Ytterligare förbättringar av genetiskt modifierade konstruktioner baserade på Pseudomonas exotoxin A inträffade efter att de variabla domänerna av monoklonala antikroppar mot p55-komponenten av den humana interleukin 2-receptorn började användas som måldelen av hybridtoxinet. I detta rekombinanta protein användes en 15-mer peptidaminosyralinker för att koppla den variabla domänen av den tunga kedjan av detta immunglobulin till den variabla domänen av dess lätta kedja och C-terminalen av den lätta kedjan till N-terminalen av det trunkerade Pseudomonas-toxinet (se fig. II.22, G). Sådana hybridtoxinmolekyler visade sig också vara mycket specifika cytotoxiska medel mot humana leukemiceller som uttrycker interleukin 2-receptorer på deras yta.
Det utvecklade tillvägagångssättet visade möjligheten att använda specifika antikroppar som måldelar av hybridtoxiner. Detta ger forskare en universell metod för riktad tillförsel av toxiner, som i framtiden kommer att göra det möjligt att utöva en cytotoxisk effekt på alla grupper av celler som uttrycker specifika antigener på sin yta, d.v.s. avsevärt utöka antalet mål för kemoterapeutiska effekter med användning av rekombinanta proteiner.
Förutom Pseudomonas har exotoxin A, difteritoxin, tumörnekrosfaktor och ricin A-kedja framgångsrikt använts som den aktiva beståndsdelen i hybridtoxiner. Eftersom A-proteinet interagerar selektivt med de konstanta (Fc) delarna av G-klassens immunoglobuliner hos många däggdjur, binder ett sådant hybridtoxin, parat med ett immunglobulin framställt mot vilket antigen som helst på cellytan, selektivt till dessa celler och dödar dem. Sådana immunotoxiner är ett annat potentiellt antitumörmedel och kan användas mot celler som uttrycker specifika antigener på sin yta.
Ris. II.23. Användning av ett fusionsprotein för att reglera genuttryck
Genteknikmetoder öppnar för oändliga möjligheter för att konstruera nya proteiner genom att kombinera olika funktionella domäner av polypeptidkedjor i olika kombinationer. Produktionen av riktade hybridtoxiner illustrerar möjligheterna med ett sådant tillvägagångssätt inom proteinteknik. Som en sista illustration av möjligheterna med denna grupp av metoder, låt oss betrakta ett hybridprotein som en ny regulator av genaktivitet. Vid konstruktion av ett sådant protein genom genteknik ersattes den DNA-bindande domänen i glukokortikoidhormonreceptorn med motsvarande domän av E. coli LexA-repressorn (Fig. II.23).
Introduktion av genoperatorsekvensen lexA in i promotorregionen av globingenen (eller andra gener) ledde till aktiveringen av promotorn under verkan av ett hybridprotein i närvaro av dexametason, ett syntetiskt hormon som interagerar med glukokortikoidreceptorn. Således, i den nya genetiska miljön, nukleotidsekvensen för genoperatören lexA E. coli fungerade som en transkriptionell förstärkare i närvaro av ett fusionsaktivatorprotein som känner igen denna sekvens. Resultaten av arbetet visar möjligheten att skapa nya proteiner - regulatorer av genaktivitet genom att kombinera kända funktionella domäner.
Utvecklingen av proteinteknik begränsas till stor del av bristande kunskap om de strukturella och funktionella sambanden i proteiner, vilket beror på studieobjektets komplexitet. Många arbeten som syftar till att studera sådana samband är som regel av empirisk natur och slutar med lokaliseringen av aminosyror som är nödvändiga för funktionen hos enzymernas aktiva centra. Därför är huvuduppgiften för proteinteknik - att erhålla ett protein med önskade egenskaper från en känd sekvens av aminosyrarester - fortfarande långt ifrån löst. Ändå är det även nu ibland möjligt att målmedvetet ändra vissa egenskaper hos existerande enzymer genom att ersätta ett litet antal aminosyrarester i deras polypeptidkedjor med användning av platsriktad mutagenes.
Dictionary Elution Elution är en metod för att extrahera ett ämne (virus) från en fast bärare genom att tvätta ut Displaymetod Displaymetod är en metod för att presentera heterologa proteiner/peptider på ytan av virus, celler eller cellfria kulturer för att välja proteiner eller peptider med erforderliga egenskaper Biosensor Biosensor - analytiskt system (biologiskt material + omvandlare Elution Elution är en metod för att extrahera ett ämne (virus) från en fast bärare genom att tvätta ur den. Displaymetod Displaymetod är en metod för att presentera heterologa proteiner/peptider på ytan av virus, celler eller cellfria egenskaper Biosensor Biosensor är ett analytiskt system (biologiskt material + transduktor) som gör det möjligt att detektera ämnen i testprovet och uppskatta deras koncentrationer
Proteinteknik 4 En uppsättning metoder och tillvägagångssätt för att studera proteiner och erhålla proteiner med nya egenskaper HUVUDMÅL Skapa ett bibliotek av nukleotid- och aminosyrasekvenser Undersöka effekterna av enstaka aminosyrarestsubstitutioner på proteinveckning och funktion Utveckla metoder för effektiv modifiering av proteiner att ge dem nödvändiga egenskaper Utveckla metoder och tillvägagångssätt för screening och urval av proteiner med önskade egenskaper
Rationell design Rationell design Behovet av kunskap om proteinets rumsliga organisation Behovet av kunskap om intra- och intermolekylära interaktioner Imperfekta metoder och utrustningsriktning som syftar till att skapa nya proteiner de novo genom sin rumsliga design
Riktad utveckling av proteinmolekyler en riktning som syftar till att skapa nya proteiner genom selektion 1 erhåller klonbibliotek av slumpmässiga aminosyrasekvenser 2 selektion av polypeptidkedjor som har åtminstone en liten grad av de önskade egenskaperna 3 med slumpmässig mutagenes erhåller nya proteinklonbibliotek som används i nästa urvalsomgång eller genom att använda genetiskt modifierade konstruktioner som uttrycker nya proteiner
Riktad utveckling av proteinmolekyler (varianter) rationell redesign med användning av platsriktad mutagenes ersätter specifika aminosyrarester i det aktiva stället för enzymutvecklingen av proteinytor genom mutationer förändra delar av polypeptidkedjan i närheten av aminosyrarester som är nära på ytan av proteinkulan, men belägna på ett betydande avstånd i polypeptidkedjan från varandra
Screening och urval av proteiner med önskade egenskaper slumpmässig screening förbättrat screeningselektion varje protein testas för de önskade egenskaperna; urvalet av proteiner från biblioteket är slumpmässigt, varje protein undersöks med avseende på närvaron av de erforderliga egenskaperna; valet av proteiner från biblioteket är slumpmässigt möjligt om objekten som utgör biblioteket skiljer sig fenotypiskt (till exempel genom närvaron av enzymatisk aktivitet) villkor skapas för selektivt bevarande av bibliotekskomponenterna som har vissa egenskaper (fag, cell) display) skapas för selektivt bevarande av bibliotekskomponenterna, som har vissa egenskaper (fag, celldisplay) detektion av ett protein med de erforderliga egenskaperna bland ett stort antal makromolekyler som utgör det resulterande klonbiblioteket
Fagvisning Syfte - att exponera främmande proteiner på fagens yta Metoden utvecklades 1985 för den filamentösa bakteriofagen M13. (pIII- och pVIII-generna är lämpliga målställen för insättning av ett främmande cDNA-fragment) Målet är att exponera främmande proteiner på fagens yta. Metoden utvecklades 1985 för den filamentösa bakteriofagen M13. (pIII- och pVIII-generna är lämpliga ställen för insättning av ett främmande cDNA-fragment) konstruera en fusionsgen bestående av de kodande sekvenserna för målproteinet och ett av faghöljesproteinerna med bakteriofaginfekterar E. coli under fagsammansättningen fusionsproteiner inkorporeras in i fagpartikeln
Phagemid Helper phage Faggenom Infektion av E.coli med hjälparfag plasmidbibliotek/fagemidtransformerade E.coli-celler infekteras med hjälparfag för att producera fagpartiklar ytexponerade med olika målproteinvarianter av plasmidbibliotek/fagemidtransformerade E.coli celler, infekteras med en hjälpfag för att erhålla fagpartiklar, på vars yta olika varianter av målproteinet exponeras
Utsikter för praktisk användning av proteinteknik Medicin: *för att skaffa nya läkemedel; för skapandet av diagnostiska verktyg och produktion av vacciner; *för studier av mekanismerna för immunsvaret, såväl som sjukdomar immunförsvar Ekologi: *att erhålla biokatalysatorer i form av hela celler med enzymer immobiliserade på ytan; *att skaffa biosensorer för diagnostik och övervakning miljö; *för att skapa bioadsorbenter för att avlägsna giftiga ämnen och tungmetalljoner från miljön
Mätning av glukos med hjälp av en enzymelektrod (schematisk representation av L. Clarks experiment). Oxidation av glukos med enzymet glukosoxidas i närvaro av syre: glukos + O 2 H 2 O 2 + glukono-1,5-lakton. H2O2 reduceras på en platinaelektrod vid en potential av +700 mV; strömmen som flyter i kretsen är proportionell mot koncentrationen av väteperoxid (dvs indirekt glukos).
Ordbok Immobilisering Immobilisering är en begränsning av rörligheten av molekyler och deras bekräftelse omarrangemang Aerotank Aerotank är ett avloppsvattenreningssystem, tankar i vilka WW, mikrobiellt slam och luft blandas. Rening av vatten, jord och atmosfär med hjälp av biologiska objekts metaboliska potential - växter, svampar, insekter, maskar och andra organismer Immobilisering Immobilisering är begränsningen av rörligheten av molekyler och deras bekräftelse omarrangemang och luft Metantank Metantank är en reservoar för biologisk bearbetning av organiska föroreningar med hjälp av bakterier under anaeroba förhållanden Bioremediering Bioremediering är en uppsättning metoder för att behandla vatten, jord och atmosfär med hjälp av den metaboliska potentialen hos biologiska objekt - växter, svampar, insekter, maskar och andra organismer
Klassificering av enzymer Klass Katalyserade reaktioner Exempel på enzymer Oxidoreduktaser Reduktiva och oxidativa reaktioner Mer än 200 enzymer är kända. Katalas, glukosoxidas Transferaser Reversibel överföring av grupper av atomer från donatorer till acceptorer. Mer än 450 enzymer är kända. Pyruvatkinas, proteinkinas Hydrolaser Hydrolysreaktioner Mer än 200 hydrolaser är kända. Proteas, amylas, cellulas Lyaser Icke-hydrolytisk klyvning av grupper av atomer från substratet med bildning av dubbelbindningar. Mer än 100 lyaser är kända. Aspartas, fumaras Isomeraser Intramolekylära omlagringsreaktioner av organiska föreningar Mer än 50 enzymer är kända. Glukoseimerasligaser. Vidhäftningsreaktioner av två olika molekyler till varandra Mer än 100 är kända DNA-ligas, tryptofansyntetas
Mikroorganismer Källor till enzymer Baciller är biosyntetiserare av ribonukleaser, deoxiribonukleaser och proteaser, medan jäst är biosyntetisatorer av glukoamylaser, invertaser och sura fosfatasväxter. Amylaser isoleras från korn, surt fosfatas från korn, surt fosfatas och pepparrotsoxid. Magen på grisar används för att erhålla pepsin.Laktatdehydrogenas isoleras från hjärtat hos nötkreatur och alkaliskt fosfatas isoleras från magen. Grismagen används för att producera pepsin
Immobiliseringsmetoder Fysiska metoder Kemiska metoder adsorption på en olöslig bärare, inkludering i geléns porer, rumslig separation med hjälp av semipermeabelt membran och andra är baserade på skapandet av nya kovalenta bindningar mellan enzymet och bäraren
Fördelarna med immobiliserade enzymer är att separera enzymerna från reaktionsmediet, stoppa reaktionen vid rätt tidpunkt och erhålla en produkt som inte är kontaminerad med enzymet; utföra processen i ett kontinuerligt läge och kontrollera reaktionshastigheten; ändra egenskaperna hos katalysatorn, dess specificitet, beroende av reaktionsbetingelser och känslighet för denaturerande effekter; reglera enzymets katalytiska aktivitet genom att verka på bäraren
Enzymer i bioteknisk produktion Enzymkälla, immobiliseringsmetod Bioteknik Acetylneutraminat -9-fosfatsyntas Enzym E. coli. Inkorporering i polyakrylamidgel. Syntes av sialinsyror. Peroxidas Ett enzym från pepparrot. Sampolymerisation och inkorporering i alginatgelen. Oxidation av fenol i avloppsvatten. 3-ketosteroiddehydrogenasceller från Mycobacterium globiformis. Inkorporering i polyakrylamidgel. Transformation av hydrokortison till prednisolon
Lavryashina M.B. KemSU Ekologiska bioteknikmetoder Biologisk rening av avloppsvatten Bio(fyto)sanering Skapande av biosäkra insekticider och herbicider Skapande av biosäkra insekticider och herbicider Erhålla ren energi Skapande av lantbruksväxter som är resistenta mot sjukdomar Bakteriell urlakning av metaller Kloning av hotade och utdöda djurarter
Reningsmetoder för avloppsvatten Mekanisk (sedimentering, filtrering) Mekanisk Kemisk (exponering för reagens) Kemisk Fysikalisk-kemiska Biologisk (biokemisk självrening)) Biologisk Bioteknikens viktigaste problem är rening av avloppsvatten
Aerotanks fungerar i kombination med en utjämnare, sedimenteringstankar, en slamregenerator och en slamkomprimator (press). aerotank aerotank
Metantank Metantank (från metan och engelsk tank - tank, cistern) Bakteriegrupper Initiala ämnen Produkter HYDROLYTISKA ACETOGEN Organiska föroreningar Högre fettsyror VÄTEPRODUCERANDE Högre fettsyror H 2, CO 2, CH 3 COOH METAN PRODUCERANDE H,2 CH 3 COOH CH 4, CO 2
Faser av metanjäsning 1 polymer biohydrolys och acidogenes (organiska ämnen omvandlas till högre fettsyror, acetat och väte) 2 acetogenes och dehydrering (acetat och väte bildas av högre fettsyror) 3 Metanogenes (metan, väte och koldioxid bildas från acetat)
jag fas. CELLULOS UTVECKLING (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) PROTEOLITISK PROTEOLITISK (Clostridium, Petrococcus) Fas II. ACETOGEN (Syntrophobacter wolinii) fas III. METANGENERATORER (Metanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus vannielii) Exempel på mikroorganismer
BIOREMEDIERING Metoden bygger på mikroorganismers förmåga att utnyttja komplexa organiska ämnen och bryta ner dem till enkla "biologiskt säkra" ämnen Molekylärbiologi och genetik Ekologi Ingenjörsvetenskap Mikrobiologi BIOREMEDIATION
Bioremediering. Närmar sig. Användning av aktiviteten hos naturliga "vilda" mikroorganismer Användning av aktiviteten hos naturliga "vilda" mikroorganismer (en intensifierare krävs, till exempel O 2) Användning av aktiva stammar som introduceras i form av biologiska produkter på platser med intensiv förorening
Studie av den biologiska mångfalden i förorenade områden Isolering av mikroflora som kan förstöra avlägsnade föroreningar Aktivering av lokal mikroflora (biostimulering). Införande av speciella mikroorganismer-förstörare i förorenade områden (bioremediation) Bioremediation. Etapper.
FÖRURENSNINGAR Kemisk analys Ingenjörsteknologi Biostimulering (Naturliga mikrobiella samhällen)Biostimulering Bioremediering (Artificiella mikrobiella biologiska produkter)Bioremediering Övervakning av bioremediering Biofytoremediation (Communities av växter och mikroorganismer) Biofytoremediation
Konstruktion av transgena växter som är resistenta mot skadeinsekter Enzymhämmare splittring av polysackarider Växter 4. Modifiering av växternas sekundära metabolismer för: a) Begränsning av nödvändiga substanser b) syntes av nya repellenter och toxiner 5. Reglering av ett skyddande svar: a) Vävnad -specifikt uttryck av gener b) Reglering av genuttryck av olika naturliga och artificiella faktorer Ökad stabilitet hos transgena växter mot svamppatogenen Phomopsis helianhi Ökad resistens hos transgena växter mot svamppatogenen Phomopsis helianhi A B A - icke-transgen växt B - transgen växt A - icke-transgen växt B - transgen växt
Provlistaämnen som ingår i testet för tillgodoräknande 1. Bioteknikens historia. Kännetecken för historiska perioder. De viktigaste upptäckterna som spelade en viktig roll i vetenskapens utveckling. 2. Allmänna begrepp bioteknik: biotekniskt system, bioteknisk process, biotekniskt objekt. 3. Biotekniska objekt, definition, karakterisering av platsen för ett bioobjekt i ett biotekniskt system, klassificering, exempel praktisk applikation. 4. Mikroorganismer som biologiska objekt. Exempel, praktisk användning inom bioteknik. 5. Cell- och vävnadskulturer som biologiska objekt. Exempel, praktisk användning inom bioteknik. 6. Bioteknologisk process. Etapper. Kort beskrivning av stadierna i den biotekniska processen. 7. Egenskaper hos mikroorganismer som objekt för urval. Urval av mikroorganismer inom bioteknik. 8. Mutagenes: definition, former av mutagenes, mutagena faktorer. 9. Urval av mutanta mikroorganismer som skapats i urvalsprocessen i det förberedande skedet av den biotekniska processen. 10. Urval av biologiska objekt. Stadier, tillvägagångssätt, metoder.
11. Genteknik: syfte, teknik, biologiska objekt, exempel på praktisk tillämpning, moderna prestationer. 12. Enzymer av genteknik. Klassificering, egenskaper hos katalyserade reaktioner. 13. Metoder för att erhålla en gen inom genteknik. Kort beskrivning, fördelar och nackdelar med metoderna. 14. Vektorer inom genteknik. Definition, klassificeringar, krav, en kort beskrivning av vektorer. 15. Rekombinant DNA. Definition, syfte, metoder för att erhålla rekombinant DNA inom genteknik. 16. Metoder för att introducera rekombinant DNA i en mottagarcell och selektera modifierade celler inom genteknik. 17. Växttransgenes. Vektor. Grundläggande strategier. Metoder för att introducera transgener och selektera transgena organismer. 18. Djurtransgenes. Vektor. Grundläggande strategier. Metoder för att introducera transgener och selektera transgena organismer. 19. Cellteknik: syfte, teknik, biologiska föremål, exempel på praktisk tillämpning, moderna prestationer. 20. Metoder för odling av växtceller och vävnader. Odlingsförhållanden, klassificering och korta egenskaper hos växtkulturer i cellteknik
21. Somatiska hybrider av växter. Produktionsteknik, moderna prestationer, exempel på praktisk tillämpning. 22. Protoplaster: definition, användning vid cellteknik, metoder och villkor för isolering av protoplaster. 23. Odling och fusion av protoplaster i cellteknik. Metoder, förhållanden, fusogener. 24. Praktisk användning av cellkulturer och växtvävnader. Biosyntes och biotransformation, mikroförökning, exempel på transgena växter med värdefulla egenskaper. 25. Animal cell engineering. Metoder, föremål, teknik, moderna prestationer, praktisk tillämpning. 26. Cell- och vävnadskulturer av djur. Klassificeringar av grödor, odlingsförhållanden, media, metoder för att erhålla somatiska hybrider, praktisk tillämpning. 27. Stamceller. Karakteristisk. Klassificering. Ansökningsmöjligheter. 28. Kloning. Metodkaraktäristik. Klassificering. Ansökningsmöjligheter. 29. Bioteknologisk process. Odlingsstadiet. Huvudstadier, karakterisering av media för mikroorganismer, växt- och djurceller. Utrustning. 30. Bioteknologisk process. Odlingsstadiet. Metoder för odling av biologiska föremål. Stadier av kulturtillväxt i en bioreaktor, syntes av målprodukten.
31. Bioteknologisk process. Stadiet för att få produkten. De viktigaste stadierna och metoderna för separation och rening av en bioteknisk produkt. Exempel på biotekniska produkter. 32. Ekologisk bioteknik: syfte, metoder, biologiska föremål, exempel på praktisk tillämpning, moderna prestationer. 33. Ekologisk bioteknik. Problem dricker vatten. Aeroba reningsmetoder för avloppsvatten. 34. Ekologisk bioteknik. Problemet med dricksvatten. Anaeroba reningsmetoder för avloppsvatten. 35. Ekologisk bioteknik. Bioremediation, biofytoremediation. 36. Bioteknik: syfte, ämne, uppgifter, bioteknikens huvudriktningar. Moderna landvinningar inom bioteknikområdet. 37. Ingenjörsenzymologi. Syfte, problem. Perspektiv. Källor till enzymer. 38. Immobiliserade enzymer. Fördelar, metoder för immobilisering. 39. Immobiliserade enzymer. Bärare för immobilisering, praktisk användning. 40. Proteinteknik. Riktningar, metoder, framtidsutsikter.
