Какво е центрофугиране в химията. центрофугиране

Описание на презентацията Центрофугиране. Използването му в различни области на биологията. чрез слайдове

Центрофугиране. Използването му в различни области на биологията. Изпълнено от: Левиков, Д.А.

Центрофугиране Това е разделяне на механичните смеси на съставните им части чрез действието на центробежна сила. Устройствата, използвани за тази цел, се наричат центрофуги. Основната част на центрофугата е ротор с монтирани в нея гнезда за центрофужни тръби. Роторът се върти с висока скорост, в резултат на което се създават значителни центробежни сили, под действието на които се отделят механични смеси, например се отлагат частици, суспендирани в течност.

Процеси, протичащи в центрофуга Следните процеси се разделят на центрофугите: 1) Центробежно филтриране. 2) Центробежно утаяване. 3) Центробежно избистряне.

Центробежно филтриране Центробежното филтриране е процес за разделяне на суспензии в центрофуги с перфорирана купа. Вътрешната повърхност на такъв барабан е покрита с филтърна кърпа. Суспензията се хвърля чрез центробежна сила към стените на барабана, докато твърдата фаза остава на повърхността на тъканта, а течността преминава през слоя утайка под действието на центробежна сила и тъканта се отстранява навън през отворите в барабанът. Центробежната филтрация обикновено се състои от три последователни физични процеса: 1) филтрация с образуване на утайка; 2) уплътняване на седимента; 3) отстраняване от утайката на течността, задържана от молекулярни сили;

Центробежно утаяване Центробежното утаяване е процес на отделяне на суспензии в центрофуги с барабани с плътни стени. Суспензията се въвежда в долната част на барабана и се хвърля към стените под действието на центробежна сила. При стените се образува седиментен слой, а течността образува вътрешен слой и се измества от барабана от суспензията, влизаща в сепарацията. В същото време течността се издига нагоре, прелива през ръба на барабана и се отстранява навън. В този случай протичат два физически процеса: 1) Отлагане на твърда фаза. 2) Уплътняване на утайката.

Центробежно избистряне Центробежното избистряне е процес за отделяне на фини суспензии и колоидни разтвори. Извършва се и в твърди барабани. От гледна точка на физическата същност центробежното избистряне е процес на свободно утаяване на твърди частици в областта на центробежните сили. В барабани с плътни стени се извършва и отделянето на емулсии. Под действието на центробежна сила компонентите на емулсията, в съответствие с плътността, се подреждат под формата на ограничени слоеве: външният слой на течност с по-висока плътност и вътрешният слой на по-леката течност. Течностите се изхвърлят от барабана отделно.

В клинични и санитарни лаборатории центрофугирането се използва за отделяне на еритроцити от кръвна плазма, кръвни съсиреци от серум, твърди частици от течната част на урината и др. За тази цел се използват или ръчни центрофуги, или електрически центрофуги, чиято скорост на въртене може да се регулира. Ултрацентрофугите, чиято скорост на ротора надвишава 40 000 rpm, обикновено се използват в експерименталната практика за разделяне на клетъчни органели, разделяне на колоидни частици, макромолекули и полимери.

Метод на центрофугиране в цитологията Методът на диференциално центрофугиране се използва за фракциониране на клетките, т.е. разделяне на съдържанието им на фракции в зависимост от специфичното тегло на различните органели и клетъчни включвания. За да направите това, фино смлените клетки се въртят в специален апарат - ултрацентрофуга. В резултат на центрофугирането компонентите на клетките се утаяват от разтвора, като се подреждат в съответствие с тяхната плътност. Плътните структури се утаяват при по-ниски скорости на центрофугиране, докато по-малко плътните структури се утаяват при високи скорости на центрофугиране. Получените слоеве се отделят и изследват отделно.

Центрофугиране в ботаниката и физиологията на растенията Центрофугирането дава възможност да се получат различни фракции от субклетъчни частици и да се изследват свойствата и функциите на всяка фракция поотделно. Например, хлоропластите могат да бъдат изолирани от листа на спанак, измити от клетъчни фрагменти чрез многократно центрофугиране в подходяща среда и може да се изследва тяхното поведение при различни експериментални условия или да се определи техният химичен състав. Освен това е възможно, като се използват различни модификации на техниката, да се унищожат тези пластиди и да се изолират съставните им елементи чрез диференциално центрофугиране (повтарящо се утаяване на частици при различни стойности на ускорение). По този начин беше възможно да се покаже, че пластидите съдържат структури, които се отличават с много подредена структура - така наречената грана; всички грани са в рамките на хлоропласт-ограничаващата мембрана (хлоропластна обвивка). Предимствата на този метод са просто безценни, тъй като позволява да се разкрие съществуването на функционални субединици, които са част от по-големи субклетъчни частици; по-специално, използвайки метода на диференциално центрофугиране, беше възможно да се покаже, че граната са основният структурен елемент на хлоропласта.

Метод на центрофугиране във вирусологията Методът на центрофугиране с градиент на плътност на Bracke може да се използва както за изолиране, така и за количествено характеризиране на растителни вируси. Както се оказа, този метод е изпълнен с много възможности и в момента се използва широко в областта на вирусологията и молекулярната биология. При провеждане на изследвания чрез центрофугиране в градиент на плътност центрофужна епруветка се запълва частично с разтвор, чиято плътност намалява в посока от дъното към менискуса. Най-често захарозата се използва за създаване на градиент при фракционирането на растителните вируси. Преди да започне центрофугирането, вирусните частици могат или да се разпределят в разтвора, или да се нанесат в горната част на градиента. Brakke предложи три различни техники за центрофугиране с градиент на плътност. При изопепично (равновесно) центрофугиране процесът продължава, докато всички частици в градиента достигнат ниво, при което плътността на средата е равна на тяхната собствена плътност. По този начин фракционирането на частиците става в този случай според разликите в тяхната плътност. Разтворите на захароза нямат достатъчна плътност за изопикнално разделяне на много вируси. При високоскоростно зонално центрофугиране вирусът първо се прилага върху предварително създаден градиент. Частиците от всеки тип се утаяват, докато преминават през градиент под формата на зона или лента със скорост в зависимост от техния размер, форма и плътност. След това центрофугирането се прекратява, когато частиците все още продължават да се утаяват. Равновесното зонално центрофугиране е подобно на високоскоростното зонално центрофугиране, но в този случай центрофугирането продължава до достигане на изопикално състояние. Ролята на градиента на плътност при високоскоростно центрофугиране е да предотврати конвекция и да фиксира различни видове молекули в определени зони. Теорията зад центрофугирането с градиент на плътност е сложна и не е добре разбрана. На практика това е прост и елегантен метод, който се използва широко при работа с растителни вируси.

Трудности при използването на метода на центрофугиране Използването на метода на диференциално центрофугиране е свързано с много методологични трудности. Първо, когато частиците са изолирани, тяхната структура може да бъде повредена. Следователно беше необходимо да се разработят специални методи за унищожаване на клетките, които да не причиняват увреждане на структурата на субклетъчните фракции. Второ, тъй като субклетъчните частици имат мембрани, по време на освобождаването им могат да възникнат различни осмотични ефекти. Следователно, за да не се разруши ултраструктурата на изследваните обекти дори при тяхното изолиране, е необходимо внимателно да се подбере съставът на средата, в която клетките се разрушават и частиците се утаяват. И накрая, измиването на субклетъчните частици (ресуспендирането им в средата и последващото центрофугиране) може да доведе до загуба на някои съдържащи се в тях вещества, които преминават в разтвор под действието на дифузионни сили. В тази връзка понякога е трудно да се разбере кои от малките молекули наистина са елементи на изследваните структури и кои просто са били адсорбирани от повърхността им по време на процеса на изолиране. Тази ситуация затруднява точното определяне на някои от функционалните свойства на избраните обекти.

Центрофугиране Това е разделяне на механичните смеси на съставните им части.
под действието на центробежна сила. Инструменти, използвани за това
мишените се наричат центрофуги.
Основната част на центрофугата е ротор с монтиран в
той гнезди за епруветки за центрофуга. Роторът се върти с
висока скорост, което води до значителни
величината на центробежната сила, под чието влияние
механичните смеси се разделят напр
утаяване на частици, суспендирани в течност.

Процесите протичат в центрофуга

Центрофугите споделят следните процеси:
1) Центробежно филтриране.
2) Центробежно утаяване.
3) Центробежно избистряне.

центробежно филтриране

Центробежното филтриране е
процеса на отделяне на суспензии в центрофуги с
перфорирани барабани. Вътрешна повърхност
на такъв барабан се покрива с филтърна кърпа.
Суспензията се хвърля с центробежна сила към
стените на барабана, докато твърдата фаза остава включена
тъканната повърхност и течността под действието
центробежната сила преминава през слоя седимент и
тъканта се отстранява навън през отвори в барабана.
Центробежното филтриране обикновено се състои от
три последователни физически процеса:
1) филтриране с образуване на утайка;
2) уплътняване на седимента;
3) отстраняване от утайката на задържаната течност
молекулярни сили;

центробежно утаяване

центробежно утаяване
Центробежно утаяване - процес на разделяне
суспензии в центрофуги с барабани
плътни стени. Суспензията се инжектира в долната
част от барабана и под действието на центробежна сила
хвърлени по стените. Стените образуват слой
седимент, а течността образува вътрешния слой и
изместен от барабана, влизащ в сепарацията
окачване. Течността се издига нагоре
излива се върху ръба на барабана и се отстранява
навън.
В този случай протичат два физически процеса:
1) Отлагане на твърда фаза.
2) Уплътняване на утайката.

Центробежно избистряне

Центробежно избистряне - процес на разделяне
редки суспензии и колоидни разтвори. Така
същото се извършва в твърди барабани.
Физически, центробежен
изясняването е процес
свободно отлагане на твърди частици в полето
центробежни сили.
В барабани с плътни стени
извършва се и отделяне на емулсии. Под
действието на компонентите на центробежната сила
емулсии според плътността
разположени под формата на ограничени слоеве:
външния слой на течност с по-висока плътност
и вътрешен слой от по-лека течност.
Течностите се изхвърлят от барабана отделно.

В клинични и санитарни лаборатории
използване на центрофугиране
за отделяне на еритроцитите от
кръвна плазма, кръвни съсиреци
серум, плътни частици от
течна част от урината и пр. За
за тази цел, или
ръчни центрофуги, или
електрически центрофуги,
чиято скорост на въртене
може да се регулира.
Ултрацентрофуги, скорост
въртенето на роторите на които
надвишава 40 000 оборота в минута,
обикновено се използва в
експериментална практика
за отделяне на органели
клетки, отделяне на колоидни
частици, макромолекули,
полимери.

Използване на центрофугиране в паразитологията

Методът се използва за диференциране на сложни
кръвна смес, урина или изпражнения, последвано от
изолиране на хелминти от него за по-нататъшно
изследване под микроскоп и фиксиране на материала. AT
процес на центрофугиране, наличен в пробата
паразитите преминават през филтъра и се натрупват в
долно конично отделение на тръбата. Филтърна мрежа
със специално оразмерени клетки
в епруветка се намира вертикално, в резултат
какво се случва хоризонтално (странично)
филтриране на пробата. В резултат на това грубо
в него се отлагат частици несмляна храна, фибри
смесителна камера, както и паразитите и техните яйца
преминават свободно през филтъра. Така
Така паразитите се концентрират в
повърхностен слой от фина утайка и
лаборантът може само внимателно да избере
проба за микроскопия с
автоматична пипета и я нанесете на
пързалка.

Метод на центрофугиране в цитологията

Диференциален метод
центрофугирането се използва за
фракциониране на клетките, т.е. тяхната стратификация
съдържание на фракции в зависимост от конкретния
теглото на различни органели и клетъчни включвания.
За да направите това, фино разделените клетки се завъртат
специален апарат - ултрацентрофуга. AT
в резултат на центрофугиране, клетъчни компоненти
утайка от разтвора, утаяване
според неговата плътност. По-плътна
структурите се отлагат при по-ниски скорости
центрофугиране, а по-малко плътни - при висока
скорости. Получените слоеве се разделят и изследват
отделно.

10. Центрофугиране в ботаниката и физиологията на растенията

Центрофугирането дава възможност за получаване на различни
фракции от субклетъчни частици и изследвайте
свойства и функции на всяка фракция в
отделно. Например от листа спанак можете
изолирайте хлоропластите, измийте ги с
повторно центрофугиране в подходящия
среда от клетъчни фрагменти и ги изследвайте
поведение в различни експериментални
условия или определят техния химичен състав.
Освен това е възможно, като се прилагат различни модификации
техники, унищожи тези пластиди и изолира
през
диференциално центрофугиране (многократно
отлагане на частици при различни стойности
ускорение) съставните им елементи. Така
чрез беше възможно да се покаже, че пластидите съдържат
структури, които са силно подредени
структура, - така наречените зърна; всички зърна
са вътре в граничния хлоропласт
мембрани (мембраната на хлоропласта). Предимства
този метод е просто безценен, защото
разкрива съществуването
функционални субединици, които изграждат
по-големи субклетъчни частици; по-специално,
използвайки метода

11. Метод на центрофугиране във вирусологията

Методът на центрофугиране с градиент на плътност на Brakke може да бъде
да се използва както за избор, така и за придобиване
количествени характеристики на растителните вируси. Както се оказа,
Този метод е изпълнен с много възможности и е в момента
широко използвани в областта на вирусологията и молекулярната
биология. При провеждане на изследване по метода
центрофужна епруветка за центрофугиране с плътност
частично запълнен с разтвор, чиято плътност намалява в
посока от дъното към менискуса. За да създадете градиент
най-често се използва фракциониране на растителни вируси
захароза. Преди да започне центрофугирането, вирусните частици могат
или се разпределя в целия обем на разтвора, или се прилага върху
горната част на градиента. Brakke предложи три различни метода
центрофугиране с градиент на плътност. При изопипна
(равновесно) процесът на центрофугиране продължава до
докато всички частици в градиента достигнат ниво, където плътността
среда е равна на собствената им плътност. По този начин,
фракционирането на частиците настъпва в този случай в съответствие с
разлики в тяхната плътност. Разтворите на захароза нямат
достатъчна плътност за изопикно разделяне на много
вируси. С високоскоростно зонално центрофугиране вирусът
първо се прилага към предварително създадения градиент. Частици
от всеки тип седимент по едно и също време чрез градиент под формата на зона,
или ленти, със скорост в зависимост от техния размер, форма и
плътност. Центрофугирането приключва, когато частиците
продължават да се утаяват. Равновесно зонално
центрофугиране, подобно на скоростно зонално
центрофугиране, но в този случай центрофугиране

12. Трудности при използването на метода на центрофугиране

Приложение на метода на диференциално центрофугиране
изпълнен с много методологични трудности. Първо, при
отделянето на частици може да увреди тяхната структура. Така
беше необходимо да се разработят специални методи за унищожаване на клетки,
което не би причинило увреждане на структурата на субклетъчните
фракции. Второ, тъй като субклетъчните частици имат
мембрани, в процеса на тяхното освобождаване,
различни осмотични ефекти. Следователно, за това
за да не се разрушава ултраструктурата на изследваните обекти
дори когато са изолирани, е необходимо внимателно да изберете състава
среда, в която разрушаването на клетките и отлагането
частици. И накрая, измиването на субклетъчните частици
(ресуспендирането им в средата и след това повторно
центрофугиране) може да доведе до загуба на някои
съдържащи се в тях вещества, които под действието на дифузионни сили
отидете в решение.
В тази връзка понякога е трудно да се разбере коя от малките молекули
са наистина елементи от изследваните структури и които
са просто адсорбирани върху повърхността им по време на процеса на изолиране.
Тази ситуация затруднява определянето на някои
функционални свойства на избраните обекти.

Курсова работа

центрофугиране

1. Принцип на метода

Разделянето на веществата чрез центрофугиране се основава на различното поведение на частиците в центробежно поле. Суспензията от частици, поставени в епруветка, се зарежда в ротор, монтиран на задвижващия вал на центрофугата.

В центробежно поле частици с различна плътност, форма или размер се отлагат с различни скорости. Скоростта на утаяване зависи отцентробежно ускорение, право пропорционална на ъгловата скорост на ротора и разстоянието между частицата и оста на въртене:

и центробежното ускорение тогава ще бъде

Тъй като един оборот на ротора е2стр радиани, ъгловата скорост на ротора в обороти в минута може да се запише като:

Центробежното ускорение обикновено се изразява в единициж и се обадиотносително центробежно ускорение , т.е.

или

При изброяване на условията за отделяне на частици посочете скоростта на въртене и радиуса на ротора, както и времето за центрофугиране. Центробежното ускорение обикновено се изразява в единициж , изчислен от средния радиус на въртене на течния стълбвцентрофужна тръба. Въз основа на уравнението Dole и Kotzias съставиха номограма, изразяваща зависимостта на GCC от скоростта на ротора и радиуса r.

Ориз. 2 .1. Номограма за изчисляване на центробежното ускорение.

За да се определи O, стойностите на радиуса и скоростта на въртене на ротора в екстремните скали са свързани с права линия; точката на пресичане на тази права линия със средната скала дава желаната стойност на центробежното ускорение. Трябва да се има предвид, че дясната колона на числата на скалата О съответства на дясната колона с числа от скалата за скорост на ротора; ляво - ляво.

Скоростта на утаяване на сферичните частици зависи не само от центробежното ускорение, но и от плътността и радиуса на самите частици и от вискозитета на суспензионната среда. Времето, необходимо за утаяване на сферична частица в течна среда от течния менискус до дъното на центрофужната тръба е обратно пропорционално на скоростта на утаяване и се определя от следното уравнение:

къдетот - време на утаяване в секунди,rj- вискозитет на средата,гз- радиус на частицата, rз- плътност на частиците, p - средна плътност, gм- разстояние от оста на въртене до менискуса на течността, gд- разстояние от оста на въртене до дъното на тръбата.

Както следва от уравнението, при дадена скорост на ротора времето необходимо за утаяване на хомогенни сферични частици е обратно пропорционално на квадрата на техните радиуси и разликата в плътността на частиците и средата и е право пропорционално на вискозитета на средата . Следователно, смес от хетерогенни, приблизително сферични частици, различаващи се по плътност и размер, може да бъде разделена или поради различно време на тяхното утаяване на дъното на тръбата при дадено ускорение, или поради разпределението на седиментиращите частици по дължината на тръбата , което се установява след определен период от време. При разделянето на веществата е необходимо да се вземат предвид такива важни фактори като плътността и вискозитета на средата. Описаните методи могат да отделят клетъчни органели от тъканни хомогенати. Основните компоненти на клетката се отлагат в следната последователност: първо цели клетки и техните фрагменти, след това ядра, хлоропласти, митохондрии, лизозоми, микрозоми и накрая рибозоми. Утаяването на несферичните частици не се подчинява на уравнението, така че частици със същата маса, но различни форми се отлагат с различни скорости. Тази характеристика се използва в изследването чрез ултрацентрофугиране на конформацията на макромолекулите.

се състои в разпределението на биологичен материал за последващи биохимични изследвания. В този случай могат да се вземат големи количества изходен биологичен материал, например инокулации на микробни клетки от партиди или непрекъснати култури, както и инокулации на растителни и животински клетки от тъканни и кръвноплазмени култури. С помощта на препаративно центрофугиране се изолират голям брой клетъчни частици за изследване на тяхната морфология, структура и биологична активност. Методът се използва също за изолиране на такива биологични макромолекули като ДНК и протеини от предварително пречистени препарати.

Аналитично центрофугиране Използва се главно за изследване на чисти или практически чисти препарати от макромолекули или частици, като рибозоми. В този случай се използва малко количество материал, а утаяването на изследваните частици се записва непрекъснато с помощта на специални оптични системи. Методът позволява получаване на данни за чистотата, молекулното тегло и структурата на материала. В бакалавърските семинари подготвителното центрофугиране се използва много по-често от аналитичното центрофугиране, така че ще се съсредоточим върху него по-подробно, въпреки че и двата метода се основават на общи принципи.

2. Подготвително центрофугиране

2 .1 Диференциално центрофугиране

Този метод се основава на разликите в скоростите на утаяване на частици, които се различават една от друга по размер и плътност. Материалът за отделяне, например тъканен хомогенат, се центрофугира при стъпаловидно увеличаване на центробежното ускорение, което е избрано така, че на всеки етап определена фракция да се отлага на дъното на епруветката. В края на всеки етап, утайката се отделя от супернатанта и се промива няколко пъти, за да се получи в крайна сметка чиста утаена фракция. За съжаление е практически невъзможно да се получи абсолютно чиста утайка; За да разберем защо това се случва, нека се обърнем към процеса, който се случва в епруветката за центрофуга в началото на всяка стъпка на центрофугиране.

Първо, всички частици от хомогената са равномерно разпределени по обема на центрофужната тръба, така че е невъзможно да се получат чисти препарати от утайките от най-тежките частици в един цикъл на центрофугиране: първата образувана утайка съдържа предимно най-тежките частици, но, в допълнение, също и определено количество от всички първоначални компоненти. Достатъчно чист препарат от тежки частици може да се получи само чрез повторно суспендиране и центрофугиране на първоначалната утайка. По-нататъшното центрофугиране на супернатанта с последващо увеличаване на центробежното ускорение води до утаяване на частици със среден размер и плътност, а след това до утаяване на най-малките частици с най-ниска плътност. На фиг. 2.3 е диаграма на фракциониране на хомогенат на черния дроб на плъх.

Ориз. 2.2. Диференциално центрофугиране на суспензия от частици в центробежно поле.

Първо, частиците се разпределят равномерно в целия обем на епруветката за центрофуга. (а): по време на центрофугиране, частиците се утаяват според техния размер и форма (b - д).

Ориз. 2.3. Схема за фракциониране на хомогенат на черния дроб на плъх на субклетъчни фракции.

Диференциалното центрофугиране изглежда е най-разпространеният метод за изолиране на клетъчни органели от тъканни хомогенати. Този метод се използва най-успешно за разделяне на такива клетъчни органели, които се различават значително една от друга по размер и плътност. Но дори и в този случай получените фракции никога не са абсолютно хомогенни и се използват други методи за тяхното по-нататъшно разделяне, описани по-долу. Тези методи, базирани на разликите в плътността на органелите, осигуряват по-ефективно разделяне чрез центрофугиране в разтвори с непрекъснат или стъпаловиден градиент на плътност. Недостатъкът на тези методи е, че е необходимо време за получаване на градиента на плътността на разтвора.

2.2 Зонно скоростно центрофугиране

Методът на скоростта на зоната, или, както още се нарича,с-зонално центрофугиране, се състои в наслояване на тестовата проба върху повърхността на разтвора с непрекъснат градиент на плътност. След това пробата се центрофугира, докато частиците се разпределят по градиента в дискретни зони или ленти. Чрез създаване на градиент на плътност е възможно да се избегне смесването на зоните в резултат на конвекция. Методът на скоростно зонално центрофугиране се използва за разделяне на РНК-ДНК хибриди, рибозомни субединици и други клетъчни компоненти.

Ориз. 2 .4. Скорост и изопикнално разделяне на частици в градиент на плътност. Преди да започне центрофугирането, суспензията на частиците се наслоява върху градиента на плътността на течността (а). При високоскоростно центрофугиране частиците не достигат изопикната точка, а при изопикническото разделяне центрофугирането продължава, докато изследваните частици не достигнат зоната със съответната плътност. (б).

2.3 Изопикническо центрофугиране

Изопикническото центрофугиране се извършва както в градиент на плътност, така и по обичайния начин. Ако центрофугирането не се извършва в градиент на плътност, препаратът първо се центрофугира, така че да се утаят частици с молекулно тегло, по-голямо от това на изследваните частици. Тези тежки частици се изхвърлят и пробата се суспендира в среда, чиято плътност е същата като тази на фракцията, която ще бъде изолирана, и след това се центрофугират, докато изследваните частици се утаят на дъното на епруветката и частиците с по-ниска плътност изплуват към повърхността на течността...

Ориз. 2.5. Изопикно разделяне без градиент на плътност.

Преди центрофугиране частиците се разпределят равномерно в целия обем на епруветката за центрофуга (а). След центрофугиране по-леките частици изплуват отгоре, докато тежките частици се утаяват на дъното на епруветката. (б)

Друг начин е да се наслои пробата върху повърхността на разтвора с непрекъснат градиент на плътност, покриващ диапазона от плътности на всички компоненти на сместа. Центрофугирането се извършва, докато плаващата плътност на частиците стане равна на плътността на съответните зони, т.е. докато частиците се разделят на зони. Методът се нарича зонално-изопикник или резонансно центрофугиране, тъй като основната точка тук е плаващата плътност, а не размерът или формата на частиците. Количеството плътност, при което частиците образуват изопикнални ивици, се влияе от естеството на суспензионната среда; частиците могат да бъдат пропускливи за някои съединения в разтвор и непропускливи за други или могат да прикрепят молекули на разтвора. При използване на зоналния ротор, митохондриите, лизозомите, пероксизомите и микрозомите се концентрират в ивици с 42%, 47%, 47% и 27% захароза, съответстващи на плътност от 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 g-cm-3 съответно. Плътността на субклетъчните органели също зависи от тяхното селективно усвояване на определени съединения. Запознаване с плъхове с нехемолитичния детергент TritonWR-1339 води до увеличаване на размера и намаляване на плътността на чернодробните лизозоми; плътността на митохондриите и пероксизомите остава непроменена. Въпреки факта, че седиментационните свойства на лизозомите, като правило, не се променят, тяхната равновесна плътност в градиента на захарозата намалява от 1,21 до 1,1, което води до съответно отделяне на лизозомно-пероксизомната фракция. Тази характеристика се използва при количественото разделяне на лизозоми, митохондрии и пероксизоми, базирано на отстраняването от хомогенна среда на всички частици с плътност, по-голяма от тази на микрозомите, и последващо изопикнално центрофугиране на утаените тежки частици.

2.4 Центрофугиране с градиент на равновесна плътност

За създаване на градиент на плътност се използват соли на тежки метали, като рубидий или цезий, както и разтвори на захароза. Проба, като ДНК, се смесва с концентриран разтвор на цезиев хлорид. Както разтвореното вещество, така и разтворителят първоначално се разпределят равномерно в обема. По време на центрофугирането се установява равновесно разпределение на концентрацията и следователно на плътносттаCsCl, тъй като цезиевите йони имат голяма маса. Под действието на центробежното ускорение молекулите на ДНК се преразпределят, като се събират под формата на отделна зона в част от епруветката със съответстваща им плътност. Методът се използва главно при аналитично центрофугиране и е използван от Meselson и Stahl за изследване на механизма на репликация на ДНК.Е. coli . Центрофугирането с градиент на равновесната плътност също е един от методите за разделяне и изследване на човешки плазмени липопротеини.

2. 5 Оформяне и извличане на градиенти

2.5.1 Характер на градиентите

За създаване на градиенти на плътност на разтворите най-често се използват разтвори на захароза, понякога с фиксирано рН. В някои случаи се получава добро разделяне, когато се използва вместо обикновена вода.д2 0. В таблицата. 2.1 показва свойствата на някои разтвори на захароза.

Концентрация, %

Свойства на разтворите на захароза

Изборът на градиента се диктува от специфичните задачи на фракционирането. Така, например, fikol, произведен от компаниятафармация Глоба химикали, може да замести захарозата в случаите, когато е необходимо да се създадат градиенти с висока плътност и ниско осмотично налягане. Друго предимство на фикола е, че не преминава през клетъчните мембрани. Соли на тежки метали, като рубидий и цезий, се използват за създаване на градиенти с по-висока плътност, но поради корозивния ефектCsClтакива градиенти се използват само в ротори, изработени от устойчиви метали, като титан.

2.5.2 Техника за градиент на стъпаловидна плътност

За да се създаде градиент на плътност, няколко разтвора с последователно намаляваща плътност се въвеждат внимателно в центрофужна епруветка с помощта на пипета. След това, върху най-горния слой, който има най-ниска плътност, пробата се наслоява под формата на тясна зона, след което епруветката се центрофугира. Плавни линейни градиенти могат да бъдат получени чрез изглаждане на стъпаловидни градиенти по време на продължително престой на разтвора. Процесът може да се ускори чрез внимателно разбъркване на съдържанието на епруветката с тел или чрез леко разклащане на епруветката.

2.5.3 Техника за създаване на плавен градиент на плътност

В повечето случаи се използва специално устройство за създаване на плавен градиент на плътност. Състои се от два цилиндрични съда със строго определен идентичен диаметър, комуникиращи помежду си в долната част със стъклена тръба с контролен клапан, който ви позволява да регулирате пропорциите, в които се смесва съдържанието на двата съда. Единият от тях е снабден с бъркалка и има изход, през който разтворът се влива в центрофужни епруветки. По-плътен разтвор се поставя в миксер; вторият цилиндър се пълни с разтвор с по-ниска плътност. Височината на колоната с разтвори в двата цилиндъра е зададена по такъв начин, че хидростатичното налягане в тях да е еднакво. По-плътният разтвор постепенно се изхвърля от миксера в центрофужните епруветки и едновременно с това се заменя с равен обем от разтвора с по-ниска плътност, влизащ в смесителя от втория цилиндър през контролния клапан. Хомогенността на разтвора в миксера се осигурява чрез постоянно разбъркване на разтвора с бъркалка. Тъй като разтворът се дренира в центрофужни епруветки, неговата плътност намалява и в епруветките се създава линеен градиент на плътност. Нелинейни градиенти могат да бъдат създадени с помощта на система, състояща се от два цилиндъра с неравен диаметър.

За формиране на градиенти на плътност с различна стръмност се използва система от две механично управлявани спринцовки, които се пълнят с разтвори с неравна плътност. Различни градиенти могат да бъдат създадени чрез промяна на относителната скорост на буталата.

2.5.4 Извличане на градиенти от центрофужни епруветки

След като центрофугирането приключи и частиците се отделят, образуваните зони трябва да се отстранят. Това става по няколко начина, най-често по метода на изместване. В основата се пробива центрофужна епруветка и в долната й част бавно се въвежда много плътна среда, например 60-70% разтвор на захароза. Разтворът отгоре се измества и фракциите се вземат с помощта на спринцовка, пипета или специално устройство, свързано чрез тръба към колектора за фракции. Ако тръбите са направени от целулоид или нитроцелулоза, фракциите се извличат чрез изрязване на тръбата със специално острие. За да направите това, центрофужна епруветка, фиксирана в стойка, се изрязва директно под желаната зона и фракцията се изсмуква със спринцовка или пипета. При подходящ дизайн на режещото устройство загубата на разтвор ще бъде минимална. Събирането на фракции се извършва и чрез пробиване на основата на епруветката с тънка куха игла. Капките, изтичащи от епруветката през иглата, се събират във фракционен колектор за по-нататъшен анализ.

2.5.5 Подготвителни центрофуги и тяхното приложение

Препаративните центрофуги могат да бъдат класифицирани в три основни групи: центрофуги с общо предназначение, високоскоростни центрофуги и подготвителни ултрацентрофуги.Центрофуги с общо предназначение дават максимална скорост от 6000 rpm-1 и OCU до 6000ж . Те се различават един от друг само по капацитет и имат редица сменяеми ротори: ъглови и с висящи очила. Една от особеностите на този тип центрофуги е големият им капацитет – от 4 до 6 dm3 , което ви позволява да ги зареждате не само с 10,50 и 100 см центрофужни тръби3 , но и съдове с вместимост до 1,25 дм3 . Във всички центрофуги от този тип роторите са неподвижно монтирани на задвижващия вал, а епруветките на центрофугата, заедно с тяхното съдържание, трябва да бъдат внимателно балансирани и да се различават по тегло с не повече от 0,25 g. трябва да бъдат поставени симетрично, една срещу други, като по този начин се осигурява равномерно разпределение на епруветките спрямо оста на въртене на ротора.

Високоскоростни центрофуги дават максимална скорост от 25 000 оборота в минута-1 и OCU до 89000ж. Камерата на ротора е оборудвана с охладителна система, която предотвратява нагряването, което възниква поради триенето по време на въртене на ротора. По правило високоскоростните центрофуги имат капацитет от 1,5 dm3 и са оборудвани със сменяеми ротори, както ъглови, така и с висящи очила.

Препаративни ултрацентрофуги дават максимална скорост до 75 000 об/мин-1 и максимално центробежно ускорение 510 000ж . Оборудвани са както с хладилник, така и с вакуумно устройство за предотвратяване на прегряване на ротора поради триенето му с въздуха. Роторите на такива центрофуги са изработени от високоякостни алуминиеви или титаниеви сплави. Използват се предимно ротори от алуминиева сплав, но в случаите, когато се изискват особено високи скорости, се използват титаниеви ротори. За намаляване на вибрациите в резултат на дисбаланс на ротора поради неравномерно пълнене на центрофужните епруветки, ултрацентрофугите имат гъвкав вал. Епруветките за центрофуга и тяхното съдържание трябва да бъдат внимателно балансирани с точност до 0,1 g. Подобни изисквания трябва да се спазват при натоварване на роторите на центрофугите за обща употреба.

2.6 Конструкция на роторите

2.6.1 Ъглови ротори и ротори с висящи кофи

Роторите на препаративните центрофуги обикновено са два вида - ъглови и висящи кофи. Наричат се ъглови, тъй като поставените в тях центрофужни тръби са винаги под определен ъгъл спрямо оста на въртене. В ротори с висящи очила епруветките са монтирани вертикално и при завъртане под действието на възникващата центробежна сила се преместват в хоризонтално положение; ъгълът на наклон спрямо оста на въртене е 90°.

При ъглови ротори разстоянието, изминавано от частиците до съответната стена на епруветката, е много малко и следователно утаяването настъпва сравнително бързо. След като се сблъскат със стените на епруветката, частиците се плъзгат надолу и образуват утайка на дъното. По време на центрофугирането възникват конвекционни потоци, които значително затрудняват отделянето на частици със сходни седиментационни свойства. Независимо от това, ротори с подобен дизайн се използват успешно за разделяне на частици, чиято скорост на утаяване варира доста.

При ротори с висящи чаши се наблюдават и конвективни явления, но те не са толкова силно изразени. Конвекцията е резултат от факта, че под действието на центробежното ускорение частиците се утаяват в посока, която не е строго перпендикулярна на оста на въртене, и следователно, както при ъглови ротори, те се удрят в стените на епруветката и се плъзгат към дъното.

Ефектите на конвекция и завихряне могат да бъдат избегнати до известна степен чрез използване на секторно оформени тръби в ротори с висяща чаша и чрез регулиране на скоростта на ротора; изброеният по-горе методът на центрофугиране в градиент на плътност също е лишен от недостатъците.

2.6.2 Непрекъснати ротори

Непрекъснатите ротори са предназначени за високоскоростно фракциониране на относително малки количества твърд материал от големи обемни суспензии, например за изолиране на клетки от хранителна среда. По време на центрофугирането към ротора непрекъснато се добавя суспензия от частици; пропускателната способност на ротора зависи от естеството на нанесения препарат и варира от 100 cm3 до 1 дм3 за 1 мин. Особеността на ротора е, че е изолирана камера със специален дизайн; съдържанието му не комуникира с външната среда и следователно не се замърсява или пръска.

2.6.3 Зонални или Андерсън ротори

Ориз. 2 .6. Стъпки на центрофугиране (a- д) в зоналния ротор

Зоналните ротори са изработени от алуминий или титаниеви сплави, които са в състояние да издържат на много значителни центробежни ускорения. Обикновено те имат цилиндрична кухина, затворена с подвижен капак. Вътре в кухината, по оста на въртене, има аксиална тръба, върху която е поставена дюза с остриета, разделяща кухината на ротора на четири сектора. Остриетата или преградите имат радиални канали, през които се инжектира градиент от аксиалната тръба към периферията на ротора. Благодарение на този дизайн на лопатките, конвекцията е сведена до минимум.

Пълненето на ротора се извършва, когато той се върти със скорост около 3000 rpm-1 . Предварително създаден градиент се изпомпва в ротора, започвайки от слой с най-ниска плътност, който е равномерно разпределен по периферията на ротора и се държи на външната му стена перпендикулярно на оста на въртене поради центробежната сила. С последващото добавяне на градиентни слоеве с по-висока плътност се получава непрекъснато изместване към центъра на по-малко плътни слоеве. След като целият градиент се изпомпва в ротора, той се запълва до пълния си обем с разтвор, наречен „възглавница“, чиято плътност е същата или малко надвишава най-високата плътност на предварително формирания градиент.

След това, през аксиалната тръба, тестовата проба се наслоява, който се измества от тръбата в обема на ротора с помощта на разтвор с по-ниска плътност, в същото време същият обем на „възглавницата“ се отстранява от периферията. След всички тези процедури скоростта на въртене на ротора се довежда до работната скорост и се извършва или зонално-скоростно, или зонално-изопикно фракциониране за необходимия период от време.. Екстракцията на фракциите се извършва при скорост на ротора 3000 rpm-1 . Съдържанието на ротора се измества чрез добавяне на „възглавница“ от периферията, като на първо място се изместват по-малко плътни слоеве. Поради специалния дизайн на аксиалния канал на ротора Anderson няма смесване на зони по време на тяхното изместване. Изходящият градиент се пропуска през записващо устройство, например клетка на спектрофотометър, с която може да се определи съдържанието на протеин чрез абсорбция при 280 nm, или през специален детектор за радиоактивност, след което се събират фракциите.

Капацитетът на зоналните ротори, използвани при средни скорости, варира от 650 до 1600 cm3 , което ви позволява да получите доста голямо количество материал. Зоналните ротори се използват за отстраняване на протеинови замърсители от различни препарати и за изолиране и пречистване на митохондриите, лизозомите, полизоми и протеини.

2.6.4 Анализ на субклетъчни фракции

Свойствата на препарата от субклетъчни частици, получени чрез фракциониране, могат да бъдат приписани на свойствата на самите частици само ако препаратът не съдържа примеси. Следователно винаги е необходимо да се оценява чистотата на получените препарати. Ефективността на хомогенизирането и наличието на примеси в препарата може да се определи чрез микроскопско изследване. Въпреки това, липсата на видими примеси все още не е надеждно доказателство за чистотата на лекарството. За да се определи количествено чистотата на получения препарат, той се подлага на химичен анализ, който позволява да се определи съдържанието на протеини или ДНК в него, да се определи неговата ензимна активност, ако е възможно, и имунологични свойства.

Анализът на разпределението на ензимите във фракционираните тъкани се основава на два основни принципа. Първият от тях е, че всички частици от дадена субклетъчна популация съдържат един и същ набор от ензими. Вторият предполага, че всеки ензим е локализиран на определено място в клетката. Ако тази позиция беше вярна, тогава ензимите биха могли да действат като маркери за съответните органели: например, цитохром оксидаза и моноамин оксидаза биха служили като митохондриални маркерни ензими, киселинни хидролази като лизозомни маркери, каталаза като пероксизомен маркер и глюкоза-6- фосфатаза - микрозомален мембранен маркер. Оказа се обаче, че някои ензими, като малат дехидрогеназа,Р -глюкуронидаза, NADP' Н-цитохром-с-редуктаза, са локализирани в повече от една фракция. Следователно към избора на ензими-маркери на субклетъчни фракции във всеки конкретен случай трябва да се подхожда много внимателно. Освен това отсъствието на маркерен ензим не означава липса на съответните органели. Вероятно е по време на фракционирането ензимът да бъде загубен от органелите или да бъде инхибиран или инактивиран; следователно, най-малко два маркерни ензима обикновено се определят за всяка фракция.

Фракция

2.7 Фракциониране чрез диференциално центрофугиране

2.7.1 Представяне на резултатите

Резултатите, получени от тъканното фракциониране, най-удобно се представят под формата на графики. По този начин, когато се изследва разпределението на ензимите в тъканите, най-добре е данните да се представят под формата на хистограми, които дават възможност за визуална оценка на резултатите от експериментите.

Ензимната активност на съдържанието на протеин в пробата се определя както в оригиналния хомогенат, така и във всяка изолирана субклетъчна фракция поотделно. Общата ензимна активност и протеиновото съдържание във фракциите не трябва да се различават значително от съответните стойности в оригиналния хомогенат.

След това ензимната активност и съдържанието на протеин във всяка фракция се изчисляват в % от общия добив, на базата на което се прави хистограма. Относителното количество протеин във всяка фракция се нанася последователно по оста на абсцисата в реда на тяхното изолиране, а относителната специфична активност на всяка фракция се нанася по оста на ординатите. По този начин ензимната активност на всяка фракция се определя от площта на лентите.

2.7.2 Аналитично ултрацентрофугиране

За разлика от препаративното центрофугиране, чиято цел е да отделя веществата и да ги пречисти, аналитичното ултрацентрофугиране се използва главно за изследване на седиментационните свойства на биологични макромолекули и други структури. Ето защо при аналитичното центрофугиране се използват ротори и записващи системи със специална конструкция: те ви позволяват непрекъснато да наблюдавате утаяването на материала.в центробежно поле.

Аналитичните ултрацентрофуги могат да достигнат скорост до 70 000 rpm -1 , като същевременно създава центробежно ускорение до 500 000ж . Техният ротор, като правило, има формата на елипсоид и е свързан с струна към двигателя, което позволява да се променя скоростта на въртене на ротора. Роторът се върти във вакуумна камера, оборудвана с хладилно устройство и има две клетки, аналитична и балансираща, които са монтирани в центрофугата строго вертикално, успоредно на оста на въртене. Балансиращата клетка служи за балансиране на аналитичната клетка и представлява метален блок с прецизна система. Има и два индексни отвора, разположени на строго определено разстояние от оста на въртене, с помощта на които се определят съответните разстояния в аналитичната клетка. Аналитична клетка, обикновено 1 cm 3 , има секторна форма. Когато е правилно монтиран в ротора, въпреки че е изправен, той работи на същия принцип като ротор с окачени кофи, създавайки почти идеални условия за утаяване. В краищата на аналитичната клетка има прозорци с кварцови стъкла. Аналитичните ултрацентрофуги са оборудвани с оптични системи, които позволяват наблюдение на утаяването на частиците през целия период на центрофугиране. На предварително определени интервали от време утаещият се материал може да се снима. При фракциониране на протеини и ДНК седиментацията се следи чрез абсорбция в ултравиолетовите лъчи, а в случаите, когато изследваните разтвори имат различни показатели на пречупване, с помощта на шлиренова система или система за интерференция на Релей. Последните два метода се основават на факта, че когато светлината преминава през прозрачен разтвор, състоящ се от зони с различна плътност, светлината се пречупва на границата на зоната. При утаяване между зоните с тежки и леки частици се образува граница, която действа като пречупваща леща; в този случай се появява пик върху фотографската плоча, използвана като детектор. В хода на утаяването границата се движи, а следователно и пикът, чиято скорост може да се използва за преценка на скоростта на утаяване на материала. Интерферометричните системи са по-чувствителни от шлиреновите системи. Аналитичните клетки са едносекторни, които се използват най-често, и двусекторни, които се използват за сравнително изследване на разтворителя и разтвореното вещество.

В биологията аналитичното ултрацентрофугиране се използва за определяне на молекулните тегла на макромолекулите, за проверка на чистотата на получените проби и за изследване на конформационни промени в макромолекулите.

2.8 Приложение на аналитично ултрацентрофугиране

2.8.1 Определяне на молекулни тегла

Има три основни метода за определяне на молекулните тегла с помощта на аналитично ултрацентрофугиране: определяне на скоростта на утаяване, метод на равновесие на утаяване и метод на приближаване на равновесието на утаяване.

Определяне на молекулното тегло чрез скоростта на утаяване - това е най-често срещаният метод. Центрофугирането се извършва при високи скорости, така че частиците, първоначално равномерно разпределени в обема, започват да се движат в ред по радиуса от центъра на въртене. Между областта на разтворителя, която вече е свободна от частици, и тази част, която ги съдържа, се образува ясна граница. Тази граница се движи по време на центрофугиране, което дава възможност да се определи скоростта на утаяване на частиците с помощта на един от горните методи, регистрирайки това движение върху фотографска плоча.

Скоростта на утаяване се определя от следната зависимост:

къдетох - разстояние от оста на въртене в cm,

т - време в секунди,

w- ъглова скорост в rad-s -1 ,

с - коефициент на утаяване "молекули.

Коефициентът на утаяване е скоростта на единица ускорение, в която се измерваЕдиници Seedberg ; 1 единица swedberg е равна на 10 _13 с. Числова стойностсзависи от молекулното тегло и формата на частиците и е стойностна характеристика на дадена молекула или надмолекулна структура. Например, коефициентът на утаяване на лизозима е 2,15С; Катал аза има коефициент на утаяване 11,35С, субединици от бактериални рибозоми - от 30 до 50С, и субединици на еукариотни рибозоми - от 40 до 60S.

къдетоМ е молекулното тегло на молекулата,Р е газовата константа,т е абсолютната температура,се коефициентът на утаяване на молекулата,д е коефициентът на дифузия на молекулата,v - частичен специфичен обем, който може да се разглежда като обемът, зает от един грам разтворено вещество, p - плътността на разтворителя.

Метод на седиментационен баланс. Определянето на молекулните тегла по този метод се извършва при относително ниски скорости на ротора, от порядъка на 7 000-8 000 rpm -1 така че молекулите с голямо молекулно тегло да не се утаяват на дъното. Ултрацентрофугирането се извършва, докато частиците достигнат равновесие, което се установява под действието на центробежни сили, от една страна, и дифузионни сили, от друга, тоест докато частиците спрат да се движат. След това, според получения градиент на концентрация, молекулното тегло на веществото се изчислява по формулата

къдетоР е газовата константа,т - абсолютна температура, o - ъглова скорост, p - плътност на разтворителя,v - частичен специфичен обем,с х ис 2 е концентрацията на разтворено вещество на разстоянияг г и g 2 от оста на въртене.

Недостатъкът на този метод е, че отнема много време за постигане на седиментационно равновесие - от няколко дни до няколко седмици при непрекъсната работа на центрофугата.

Методът за приближаване до равновесието на утаяване беше разработени, за да се отърват от недостатъците на предишния метод, свързани с голяма инвестиция на време, необходимо за „уравновесяване“. С този метод е възможно да се определят молекулните тегла, когато центрофугираният разтвор е в състояние на приближение до равновесие. Първо, макромолекулите се разпределят равномерно по целия обем на аналитичната клетка; след това, с напредването на центрофугирането, молекулите се утаяват и плътността на разтвора в областта на менискуса постепенно намалява. Промяната в плътността се записва внимателно и след това, чрез сложни изчисления, включващи голям брой променливи, молекулното тегло на дадено съединение се определя по формулите:

къдетоР е газовата константа,т е абсолютната температура,v - частичен специфичен обем, p - плътност на разтворителя,dcldr - градиент на концентрация на макромолекулата, g ми g д- разстояние съответно до менискуса и дъното на тръбата, s ми със д- концентрация на макромолекули в менискуса и на дъното на тръбата, съответно,М м иМ Р - стойности на молекулните тегла, определени от разпределението на концентрацията на веществото съответно в менискуса и дъното на епруветката.

2.8.2 Оценка на чистотата на препаратите

Аналитичното ултрацентрофугиране се използва широко за оценка на чистотата на ДНК, вирусни и протеинови препарати. Чистотата на препаратите несъмнено е много важна в случаите, когато се изисква точно определяне на молекулното тегло на молекулата. В повечето случаи хомогенността на препарата може да се прецени по естеството на границата на утаяване, като се използва методът на скоростта на утаяване: хомогенният препарат обикновено дава една рязко определена граница. Примесите, присъстващи в препарата, се появяват като допълнителен връх или рамо; те определят и асиметрията на главния връх.

2.8.3 Изследване на конформационни промени в макромолекулите

Друга област на приложение на аналитичното ултрацентрофугиране е изследването на конформационните промени в макромолекулите. Молекулата на ДНК, например, може да бъде едноверижна или двуверижна, линейна или кръгла. Под действието на различни съединения или при повишени температури ДНК претърпява редица обратими и необратими конформационни промени, които могат да бъдат определени чрез промяна на скоростта на утаяване на пробата. Колкото по-компактна е молекулата, толкова по-нисък е нейният коефициент на триене в разтвор и обратно: колкото по-малко е компактна, толкова по-голям е коефициентът на триене и, следователно, толкова по-бавно ще се утаява. По този начин разликите в скоростта на утаяване на пробата преди и след различни въздействия върху нея позволяват да се открият конформационни промени, настъпващи в макромолекулите.

В алостерични протеини, като например аспартат транскарбамоилаза, възникват конформационни промени в резултат на тяхното свързване със субстрат и малки лиганди. Дисоциацията на протеин на субединици може да бъде предизвикана чрез третирането му с вещества като урея или парахлоромеркурибензоат. Всички тези промени могат лесно да бъдат наблюдавани с помощта на аналитично ултрацентрофугиране.

Центрофугирането е разделяне на механични смеси на съставните им части чрез действието на центробежна сила. Устройствата, използвани за тази цел, се наричат центрофуги. Основната част на центрофугата е ротор с монтирани в нея гнезда за центрофужни тръби. Роторът се върти с висока скорост, в резултат на което се създават значителни центробежни сили, под действието на които се отделят механични смеси, например се отлагат частици, суспендирани в течност.

Центрофуги: 1 - ръчни: 2 - с електрическо задвижване.

В клинични и санитарни лаборатории центрофугирането се използва за отделяне от кръвна плазма, от плътни частици от течната част на урината и др. За целта се използват или ръчни центрофуги (фиг., 1) или електрически центрофуги, скоростта на въртене на който може да се регулира (фиг., 2).

Ултрацентрофугите, чиято скорост на ротора надвишава 40 000 rpm, обикновено се използват в експерименталната практика за разделяне на клетъчни органели, разделяне на колоидни частици, макромолекули и др.

Центрофугирането е разделяне на груби системи, състоящи се от течни и твърди компоненти с различна плътност, с помощта на специален апарат, наречен центрофуги. Принципът на действие на центрофугата се основава на създаването на голяма центробежна сила, под въздействието на която скоростта на разделяне на компонентите на сместа, поставена в центрофугата, се увеличава многократно в сравнение със скоростта на тяхното разделяне под действие на гравитацията.

Методът на центрофугиране се използва широко в биологията, медицината и технологиите, като често замества процесите на филтриране, утаяване и пресоване.

Центрофугата има корпус, задвижващ механизъм, ротор, работна (ограждаща) камера и контролен панел. Някои центрофуги са оборудвани с електрически часовник, който осигурява автоматично изключване и спиране в диапазона от 5 до 60 минути. Специалните центрофуги имат хладилни и вакуумни агрегати с устройства за проследяване и автоматично управление. Основната част на всяка центрофуга е роторът (в лабораторните центрофуги той обикновено се намира на вертикално монтиран вал на електродвигателя или се върти от различни зъбни колела от вала на двигателя, понякога дори ръчно). Роторът на центрофугата представлява диск (кръст) с шарнирни гнезда за метални втулки, в които са поставени епруветки, които при въртене заемат хоризонтално положение.

Понякога роторът е направен под формата на твърд метален пресечен конус с клетки за епруветки (ъглов ротор); тръбите в него са разположени под постоянен ъгъл спрямо оста на въртене (обикновено 40°). При наклонено положение на епруветките компонентите на сместа се отделят по-бързо. Разделянето на сместа се извършва в епруветки с различна форма и обем (фиг. 1). При работа на високи скорости се използват епруветки от полиетилен, тъй като стъклените се спукат. Епруветките с обработения материал, разположени една срещу друга в ротора, трябва да бъдат балансирани. Това осигурява равномерно натоварване на вала на ротора и осигурява равномерно въртене на вала на центрофугата. За балансиране на епруветките се използват специални везни (фиг. 2).

Ориз. 1. Епруветки за центрофугиране.

Ориз. 2. Центрофужни везни.

Центрофугите, използвани в индустрията, се различават от лабораторните центрофуги по по-сложна конструкция на ротора, която позволява едновременно центрофугиране на голямо количество материал или непрекъснато провеждане на процеси на разделяне.

Центрофуги с ниска скорост на ротора се използват в медицината за отделяне на урина, кръвен серум от съсиреци, утаяване на еритроцити, при серологични изследвания и др.

Микроцентрофугата (фиг. 4) се управлява ръчно; оборудвани с две сменяеми дюзи, едната от които има гнезда за микроепруветки и се използва за определяне на съвместимостта на кръвта; другият - с гнездо за поставяне на градуирана микропипета (хематокрит) - е предназначен за определяне на процента на кръвните клетки.

Ориз. 3. Ръчна центрофуга.

Ориз. 4. Микроцентрофуга.

Ръчната центрофуга (фиг. 3) има четири метални или пластмасови втулки за епруветки от 15 ml.

Лабораторната клинична центрофуга TsLK-1 (фиг. 5, 7) има три скорости на въртене (1000, 1500, 3000 rpm). Кръстосаният ротор е пригоден за 12 конвенционални центрофужни епруветки. Най-големият обем центрофугирана течност е 150 ml.

Центрофугите с висока скорост на ротора в повечето случаи са оборудвани със сменяеми ротори, предназначени за различни обеми течност и се използват за разделяне на фини суспензии.

Лабораторната настолна центрофуга TsLN-2 (фиг. 5, 2) има ъглов ротор за шест къси епруветки с общ капацитет 72 ml. Максимална скорост на въртене -9000 об/мин.

Ориз. 5. Различни лабораторни центрофуги: 1 - клинични; 2 - работен плот; 3 - ъгъл малък; 4 - неподвижно; 5 - хладилник.

Центрофугата с малък ъгъл ЦУМ-1 (фиг. 5, 3) има три взаимозаменяеми ъглови ротора с различен брой епруветки и хематокрит: ротор за 6 епруветки с общ капацитет 150 ml, ротор за 10 епруветки с общ. вместимост 120 ml, ротор за 24 епруветки с общ капацитет 120 ml, хематокрит за две капиляри. Максималната скорост на въртене е 10 000 rpm.

Центрофугата е оборудвана с електрически часовников механизъм.

Лабораторната стационарна центрофуга TsLS-2 (фиг. 5, 4) има два сменяеми ротора. Напречният ротор е оборудван с четири стоманени ръкави с вместимост 500 ml и четири стъклени епруветки за тях с вместимост 250 ml. Ъгловият ротор се доставя с 8 епруветки от полиетилен и стомана с вместимост 50-75 ml. Максималното въртене на роторите е до 6000 об/мин. Центрофугата е оборудвана с електрически часовников механизъм.

Сред специалните центрофуги е и лабораторната хладилна центрофуга CLR-1 (фиг. 5.5), предназначена за центрофугиране при ниски температури (-5° и повече) на различни вещества, които се променят дори при стайна температура – предимно протеинови суспензии. Центрофугата има три сменяеми ротора, осигуряващи различни режими на центрофугиране. Два ротора са идентични по технически характеристики с роторите на центрофугата от тип TsLS-2, третият ротор, който е поставен на допълнителна ос, развива 18 000-18 500 об/мин. Максималният обем на изследваното лекарство е 48 ml. Центрофугата е оборудвана с електрически часовников механизъм. Охлаждането на работната камера се извършва с помощта на хладилна машина.

Вижте също ултрацентрофугиране.

Курсова работа

центрофугиране

1. Принципът на метода

В центробежно поле частици с различна плътност, форма или размер се отлагат с различни скорости. Скоростта на утаяване зависи от центробежното ускорение, което е право пропорционално на ъгловата скорост на ротора и разстоянието между частицата и оста на въртене:

и центробежното ускорение тогава ще бъде

Тъй като един оборот на ротора е 2n радиана, ъгловата скорост на ротора в обороти в минута може да се запише като:

Центробежното ускорение обикновено се изразява в единици g и се нарича относително центробежно ускорение, т.е.

При изброяване на условията за отделяне на частици посочете скоростта на въртене и радиуса на ротора, както и времето за центрофугиране. Центробежното ускорение обикновено се изразява в единици g, изчислено от средния радиус на въртене на течен стълб в центрофужна тръба. Въз основа на уравнението Dole и Kotzias съставиха номограма, изразяваща зависимостта на GCC от скоростта на ротора и радиуса r.

където t е времето на утаяване в секунди, rj е вискозитетът на средата, rh е радиусът на частицата, rf е плътността на частицата, p е плътността на средата, hm е разстоянието от оста на въртене до менискуса на течността, където е разстоянието от оста на въртене до дъното на епруветката.

Подготвителното центрофугиране се състои в изолиране на биологичен материал за последващи биохимични изследвания. В този случай могат да се вземат големи количества изходен биологичен материал, например инокулации на микробни клетки от партиди или непрекъснати култури, както и инокулации на растителни и животински клетки от тъканни и кръвноплазмени култури. С помощта на препаративно центрофугиране се изолират голям брой клетъчни частици за изследване на тяхната морфология, структура и биологична активност. Методът се използва също за изолиране на такива биологични макромолекули като ДНК и протеини от предварително пречистени препарати.

Аналитичното центрофугиране се използва главно за изследване на чисти или по същество чисти препарати от макромолекули или частици, като рибозоми. В този случай се използва малко количество материал, а утаяването на изследваните частици се записва непрекъснато с помощта на специални оптични системи. Методът позволява получаване на данни за чистотата, молекулното тегло и структурата на материала. В бакалавърските семинари подготвителното центрофугиране се използва много по-често от аналитичното центрофугиране, така че ще се съсредоточим върху него по-подробно, въпреки че и двата метода се основават на общи принципи.

2. Подготвително центрофугиране

2.1 Диференциално центрофугиране

2.2 Скоростно зонално центрофугиране

Методът на зонално-скоростно или, както още се нарича, s-зонално центрофугиране, се състои в наслояване на тестовата проба върху повърхността на разтвор с непрекъснат градиент на плътност. След това пробата се центрофугира, докато частиците се разпределят по градиента в дискретни зони или ленти. Чрез създаване на градиент на плътност е възможно да се избегне смесването на зоните в резултат на конвекция. Методът на скоростно зонално центрофугиране се използва за разделяне на РНК-ДНК хибриди, рибозомни субединици и други клетъчни компоненти.

2.3 Изопикническо центрофугиране

Друг начин е да се наслои пробата върху повърхността на разтвора с непрекъснат градиент на плътност, покриващ диапазона от плътности на всички компоненти на сместа. Центрофугирането се извършва, докато плаващата плътност на частиците стане равна на плътността на съответните зони, т.е. докато частиците се разделят на зони. Методът се нарича зонално-изопикник или резонансно центрофугиране, тъй като основната точка тук е плаващата плътност, а не размерът или формата на частиците. Количеството плътност, при което частиците образуват изопикнални ивици, се влияе от естеството на суспензионната среда; частиците могат да бъдат пропускливи за някои съединения в разтвор и непропускливи за други или могат да прикрепят молекули на разтвора. При използване на зоналния ротор, митохондриите, лизозомите, пероксизомите и микрозомите се концентрират в ивици с 42%, 47%, 47% и 27% захароза, съответстващи на плътност съответно 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 g-cm -3 Плътността на субклетъчните органели също зависи от тяхното селективно усвояване на определени съединения. Въвеждането на плъхове на детергент Triton WR-1339, който не причинява хемолиза, води до увеличаване на размера и намаляване на плътността на чернодробните лизозоми; плътността на митохондриите и пероксизомите остава непроменена. Въпреки факта, че седиментационните свойства на лизозомите, като правило, не се променят, тяхната равновесна плътност в градиента на захарозата намалява от 1,21 до 1,1, което води до съответно отделяне на лизозомно-пероксизомната фракция. Тази характеристика се използва при количественото разделяне на лизозоми, митохондрии и пероксизоми, базирано на отстраняването от хомогенна среда на всички частици с плътност, по-голяма от тази на микрозомите, и последващо изопикнално центрофугиране на утаените тежки частици.

2.4 Центрофугиране с градиент на равновесна плътност

За създаване на градиент на плътност се използват соли на тежки метали, като рубидий или цезий, както и разтвори на захароза. Проба, като ДНК, се смесва с концентриран разтвор на цезиев хлорид. Както разтвореното вещество, така и разтворителят първоначално се разпределят равномерно в обема. По време на центрофугирането се установява равновесно разпределение на концентрацията и, следователно, плътността на CsCl, тъй като цезиевите йони имат голяма маса. Под действието на центробежното ускорение молекулите на ДНК се преразпределят, като се събират под формата на отделна зона в част от епруветката със съответстваща им плътност. Методът се използва главно при аналитично центрофугиране и е използван от Meselson и Stahl за изследване на механизма на репликация на ДНК на E. coli. Центрофугирането с градиент на равновесната плътност също е един от методите за разделяне и изследване на човешки плазмени липопротеини.

2.5 Оформяне и извличане на градиенти

2.5.1 Характер на градиентите

За създаване на градиенти на плътност на разтворите най-често се използват разтвори на захароза, понякога с фиксирано рН. В някои случаи се получава добро разделяне, като се използва D2 0 вместо обикновена вода. 2.1 показва свойствата на някои разтвори на захароза.

Изборът на градиента се диктува от специфичните задачи на фракционирането. Например, ficol, произведен от Pharmacia FineChemicals, може да замени захарозата в случаите, когато е необходимо да се създадат градиенти с висока плътност и ниско осмотично налягане. Друго предимство на фикола е, че не преминава през клетъчните мембрани. Солите на тежките метали, като рубидий и цезий, се използват за създаване на градиенти с по-висока плътност, но поради корозивния ефект на CsCl, такива градиенти се използват само в ротори, изработени от устойчиви метали, като титан.

2.5.2 Техника за градиент на стъпаловидна плътност

2.5.3 Техника за създаване на плавен градиент на плътност

2.5.4 Извличане на градиенти от центрофужни епруветки

2.5.5 Подготвителни центрофуги и тяхното приложение

Препаративните центрофуги могат да бъдат класифицирани в три основни групи: центрофуги с общо предназначение, високоскоростни центрофуги и подготвителни ултрацентрофуги. Центрофугите с общо предназначение дават максимална скорост от 6000 rpm и RCF до 6000 g. Те се различават един от друг само по капацитет и имат редица сменяеми ротори: ъглови и с висящи очила. Една от особеностите на този тип центрофуги е големият им капацитет – от 4 до 6 dm3, което позволява да се зареждат не само с центрофужни тръби от 10,50 и 100 cm3, но и с съдове с вместимост до 1,25 dm3. Във всички центрофуги от този тип роторите са неподвижно монтирани на задвижващия вал, а епруветките на центрофугата, заедно с тяхното съдържание, трябва да бъдат внимателно балансирани и да се различават по тегло с не повече от 0,25 g. трябва да бъдат поставени симетрично, една срещу други, като по този начин се осигурява равномерно разпределение на епруветките спрямо оста на въртене на ротора.

Високоскоростните центрофуги дават максимална скорост от 25 000 rpm-1 и RCF до 89 000 g. Камерата на ротора е оборудвана с охладителна система, която предотвратява нагряването, което възниква поради триенето по време на въртене на ротора. По правило високоскоростните центрофуги имат капацитет от 1,5 dm3 и са оборудвани със сменяеми ротори, както ъглови, така и висящи кофи.

Подготвителни ултрацентрофуги дават максимална скорост до 75 000 rpm и максимално центробежно ускорение от 510 000 g. Оборудвани са както с хладилник, така и с вакуумно устройство за предотвратяване на прегряване на ротора поради триенето му с въздуха. Роторите на такива центрофуги са изработени от високоякостни алуминиеви или титаниеви сплави. Използват се предимно ротори от алуминиева сплав, но в случаите, когато се изискват особено високи скорости, се използват титаниеви ротори. За намаляване на вибрациите в резултат на дисбаланс на ротора поради неравномерно пълнене на центрофужните епруветки, ултрацентрофугите имат гъвкав вал. Епруветките за центрофуга и тяхното съдържание трябва да бъдат внимателно балансирани с точност до 0,1 g. Подобни изисквания трябва да се спазват при натоварване на роторите на центрофугите за обща употреба.

2.6 Конструкция на роторите

2.6.1 Ъглови ротори и ротори с висящи кофи

2.6.2 Непрекъснати ротори

Непрекъснатите ротори са предназначени за високоскоростно фракциониране на относително малки количества твърд материал от големи обемни суспензии, например за изолиране на клетки от хранителна среда. По време на центрофугирането към ротора непрекъснато се добавя суспензия от частици; капацитетът на ротора зависи от естеството на нанесения препарат и варира от 100 cm3 до 1 dm3 в минута. Особеността на ротора е, че е изолирана камера със специален дизайн; съдържанието му не комуникира с външната среда и следователно не се замърсява или пръска.

2.6.3 Зонални или Андерсън ротори

Пълненето на ротора се извършва, когато той се върти със скорост около 3000 rpm-1. Предварително създаден градиент се изпомпва в ротора, започвайки от слой с най-ниска плътност, който е равномерно разпределен по периферията на ротора и се задържа на външната му стена перпендикулярно на оста на въртене поради центробежната сила. С последващото добавяне на градиентни слоеве с по-висока плътност се получава непрекъснато изместване към центъра на по-малко плътни слоеве. След като целият градиент се изпомпва в ротора, той се запълва до пълния си обем с разтвор, наречен „възглавница“, чиято плътност е същата или малко надвишава най-високата плътност на предварително формирания градиент.

След това през аксиалната тръба се наслоява тестовата проба, която се измества от тръбата в обема на ротора с помощта на разтвор с по-ниска плътност, докато същият обем на "възглавницата" се отстранява от периферията. След всички тези процедури скоростта на въртене на ротора се настройва към работната скорост и се извършва или зонално-скоростно, или зонално-изопикно фракциониране за необходимия период от време. Извличането на фракции се извършва при скорост на ротора 3000 rpm - min-1. Съдържанието на ротора се измества чрез добавяне на "възглавница" от периферията, като на първо място се изместват по-малко плътни слоеве. Поради специалния дизайн на аксиалния канал на ротора Anderson няма смесване на зони по време на тяхното изместване. Изходящият градиент се пропуска през записващо устройство, например клетка на спектрофотометър, с която може да се определи съдържанието на протеин чрез абсорбция при 280 nm, или през специален детектор за радиоактивност, след което се събират фракциите.

Капацитетът на зоналните ротори, използвани при средни скорости, варира от 650 до 1600 cm3, което прави възможно получаването на доста голямо количество материал. Зоналните ротори се използват за отстраняване на протеинови замърсители от различни препарати и за изолиране и пречистване на митохондриите, лизозомите, полизоми и протеини.

2.6.4 Анализ на субклетъчни фракции

Анализът на разпределението на ензимите във фракционираните тъкани се основава на два основни принципа. Първият от тях е, че всички частици от дадена субклетъчна популация съдържат един и същ набор от ензими. Вторият предполага, че всеки ензим е локализиран на определено място в клетката. Ако тази позиция беше вярна, тогава ензимите биха могли да действат като маркери за съответните органели: например, цитохром оксидаза и моноамин оксидаза биха служили като митохондриални маркерни ензими, киселинни хидролази като лизозомни маркери, каталаза като пероксизомен маркер и глюкоза-6- фосфатаза - микрозомален мембранен маркер. Оказа се обаче, че някои ензими, например малат дехидрогеназа, P-глюкуронидаза, NADP-H-цитохром-c-редуктаза, са локализирани в повече от една фракция. Следователно изборът на маркерни ензими на субклетъчни фракции във всяка конкретна Към случая трябва да се подхожда много внимателно. Освен това, липсата на маркерен ензим не означава липса на съответните органели. Вероятно е по време на фракционирането ензимът да бъде загубен от органелите или да бъде инхибиран или инактивиран, така че поне две маркерните ензими обикновено се определят за всяка фракция.

Фракция	Обем, см"	Общо развъждане	Екснулация, 660 nm	Единици за ензимна активност	Добив на дейност във фракция, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Фракциониране чрез диференциално центрофугиране

2.7.1 Представяне на резултатите

2.7.2 Аналитично ултрацентрофугиране

Аналитичните ултрацентрофуги могат да достигнат скорости до 70 000 rpm, като същевременно генерират центробежно ускорение до 500 000 g. Техният ротор, като правило, има формата на елипсоид и е свързан с струна към двигателя, което позволява да се променя скоростта на въртене на ротора. Роторът се върти във вакуумна камера, оборудвана с хладилно устройство и има две клетки, аналитична и балансираща, които са монтирани в центрофугата строго вертикално, успоредно на оста на въртене. Балансиращата клетка служи за балансиране на аналитичната клетка и представлява метален блок с прецизна система. Има и два индексни отвора, разположени на строго определено разстояние от оста на въртене, с помощта на които се определят съответните разстояния в аналитичната клетка. Аналитичната клетка, чийто капацитет обикновено е 1 cm3, има секторна форма. Когато е правилно монтиран в ротора, въпреки че е изправен, той работи на същия принцип като ротор с окачени кофи, създавайки почти идеални условия за утаяване. В краищата на аналитичната клетка има прозорци с кварцови стъкла. Аналитичните ултрацентрофуги са оборудвани с оптични системи, които позволяват наблюдение на утаяването на частиците през целия период на центрофугиране. На предварително определени интервали от време утаещият се материал може да се снима. При фракциониране на протеини и ДНК седиментацията се следи чрез абсорбция в ултравиолетовите лъчи, а в случаите, когато изследваните разтвори имат различни показатели на пречупване, с помощта на шлиренова система или система за интерференция на Релей. Последните два метода се основават на факта, че когато светлината преминава през прозрачен разтвор, състоящ се от зони с различна плътност, светлината се пречупва на границата на зоната. При утаяване между зоните с тежки и леки частици се образува граница, която действа като пречупваща леща; в този случай се появява пик върху фотографската плоча, използвана като детектор. В хода на утаяването границата се движи, а следователно и пикът, чиято скорост може да се използва за преценка на скоростта на утаяване на материала. Интерферометричните системи са по-чувствителни от шлиреновите системи. Аналитичните клетки са едносекторни, които се използват най-често, и двусекторни, които се използват за сравнително изследване на разтворителя и разтвореното вещество.

2.8 Приложение на аналитично ултрацентрофугиране

2.8.1 Определяне на молекулни тегла

Определянето на молекулното тегло чрез скоростта на утаяване е най-разпространеният метод. Центрофугирането се извършва при високи скорости, така че частиците, първоначално равномерно разпределени в обема, започват да се движат в ред по радиуса от центъра на въртене. Между областта на разтворителя, която вече е свободна от частици, и тази част, която ги съдържа, се образува ясна граница. Тази граница се движи по време на центрофугиране, което дава възможност да се определи скоростта на утаяване на частиците с помощта на един от горните методи, регистрирайки това движение върху фотографска плоча.

Скоростта на утаяване се определя от следната зависимост:

където x е разстоянието от оста на въртене в cm,

t - време в s,

w е ъгловата скорост в rad-s-1,

s е коефициентът на утаяване на „молекулата.

Коефициентът на утаяване е скоростта на единица ускорение, той се измерва в единици Seedberg; 1 единица на Swedberg е равна на 10_13 s. Числената стойност на s зависи от молекулното тегло и формата на частиците и е стойност, характерна за дадена молекула или надмолекулна структура. Например, коефициентът на утаяване на лизозима е 2,15 S; каталазата има коефициент на утаяване от 11,35S, бактериални рибозомни субединици от 30 до 50S и еукариотни рибозомни субединици от 40 до 60S.

където M е молекулното тегло на молекулата, R е газовата константа, T е абсолютната температура, s е коефициентът на утаяване на молекулата, D е коефициентът на дифузия на молекулата, v е частичният специфичен обем, който може да бъде разглеждан като обем, зает от един грам от разтвореното вещество, p е плътността на разтворителя.

Метод на седиментационен баланс. Определянето на молекулните тегла по този метод се извършва при относително ниски скорости на ротора, от порядъка на 7 000-8 000 rpm-1, така че молекулите с голямо молекулно тегло да не се утаяват на дъното. Ултрацентрофугирането се извършва, докато частиците достигнат равновесие, което се установява под действието на центробежни сили, от една страна, и дифузионни сили, от друга, тоест докато частиците спрат да се движат. След това, според получения градиент на концентрация, молекулното тегло на веществото се изчислява "според формулата

където R е газовата константа, T е абсолютната температура, ω е ъгловата скорост, p е плътността на разтворителя, v е частичният специфичен обем, cx и c2 са концентрацията на разтвореното вещество на разстояния r и r2 от ос на въртене.

Методът за доближаване до равновесието на утаяване е разработен, за да се отърват от недостатъците на предишния метод, свързани с голяма инвестиция на време, необходимо за "установяване на равновесие. Използвайки този метод, молекулните тегла могат да бъдат определени, когато центрофугираният разтвор е в състояние на подход към равновесие Първо, макромолекулите се разпределят равномерно в целия обем на аналитичната клетка, след това, докато центрофугирането продължава, молекулите се утаяват и плътността на разтвора в областта на менискуса постепенно намалява. Промяната в плътността е внимателно записано и след това, чрез сложни изчисления, включващи голям брой променливи, молекулното тегло на дадено съединение се определя по формулите:

където R е газовата константа, T е абсолютната температура, v е частичният специфичен обем, p е плътността на разтворителя, dcldr е концентрационният градиент на макромолекулата, hm и gd са разстоянието до менискуса и дъното на епруветката, съответно, cm и sd са концентрацията на макромолекулите в менискуса и y на дъното на епруветката, съответно, Mm и MR са стойностите на молекулните тегла, определени от разпределението на концентрацията на веществото в менискус и дъното на тръбата, съответно.

2.8.2 Оценка на чистотата на препаратите

2.8.3 Изследване на конформационни промени в макромолекулите