Čo je to odstreďovanie v chémii. odstreďovanie

Prezentácia Popis Centrifugácia. Jeho využitie v rôznych oblastiach biológie. pomocou diapozitívov

Centrifugácia. Jeho využitie v rôznych oblastiach biológie. Doplnili: Levikov, D. A.

Odstreďovanie Ide o rozdeľovanie mechanických zmesí na ich jednotlivé časti pôsobením odstredivej sily. Zariadenia používané na tento účel sa nazývajú centrifúgy. Hlavnou časťou odstredivky je rotor, v ktorom sú namontované hniezda pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča vysokou rýchlosťou, v dôsledku čoho vznikajú značné odstredivé sily, pôsobením ktorých sa oddeľujú mechanické zmesi, napríklad sa ukladajú častice suspendované v kvapaline.

Procesy prebiehajúce v odstredivke V odstredivkách sa delia tieto procesy: 1) Odstredivá filtrácia. 2) Odstredivé usadzovanie. 3) Odstredivé čírenie.

Odstredivá filtrácia Odstredivá filtrácia je proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s perforovanou misou. Vnútorný povrch takéhoto bubna je pokrytý filtračnou tkaninou. Suspenzia je vrhaná odstredivou silou na steny bubna, zatiaľ čo tuhá fáza zostáva na povrchu tkaniny a kvapalina prechádza cez vrstvu sedimentu pôsobením odstredivej sily a tkanina je odvádzaná smerom von cez otvory v bubon. Odstredivá filtrácia zvyčajne pozostáva z troch po sebe nasledujúcich fyzikálnych procesov: 1) filtrácia s tvorbou sedimentu; 2) zhutnenie sedimentu; 3) odstránenie kvapaliny zadržiavanej molekulárnymi silami zo sedimentu;

Odstredivé usadzovanie Odstredivé usadzovanie je proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s bubnami s pevnými stenami. Suspenzia sa zavádza do spodnej časti bubna a pôsobením odstredivej sily sa vrhá na steny. Na stenách sa vytvára vrstva sedimentu a kvapalina tvorí vnútornú vrstvu a je vytláčaná z bubna suspenziou vstupujúcou do separácie. Súčasne kvapalina stúpa nahor, preteká cez okraj bubna a je odvádzaná von. V tomto prípade prebiehajú dva fyzikálne procesy: 1) Depozícia tuhej fázy. 2) Zhutnenie sedimentu.

Odstredivé čírenie Odstredivé čírenie je proces oddeľovania jemných suspenzií a koloidných roztokov. Vykonáva sa aj v pevných bubnoch. Z hľadiska fyzikálnej podstaty je odstredivé čírenie procesom voľného usadzovania pevných častíc v poli odstredivých síl. V bubnoch s pevnými stenami sa tiež vykonáva separácia emulzií. Pôsobením odstredivej sily sú zložky emulzie v súlade s hustotou usporiadané vo forme ohraničených vrstiev: vonkajšia vrstva kvapaliny s vyššou hustotou a vnútorná vrstva ľahšej kvapaliny. Kvapaliny sa vypúšťajú z bubna oddelene.

V klinických a sanitárnych laboratóriách sa centrifugácia používa na oddelenie červených krviniek z krvnej plazmy, krvných zrazenín zo séra, pevných častíc z tekutej časti moču atď. Na tento účel sa používajú buď ručné centrifúgy alebo elektrické centrifúgy, rýchlosť otáčania ktorých je možné upraviť. Na separáciu bunkových organel, separáciu koloidných častíc, makromolekúl a polymérov sa v experimentálnej praxi zvyčajne používajú ultracentrifúgy, ktorých rýchlosť rotora presahuje 40 000 ot./min.

Metóda centrifugácie v cytológii Metóda diferenciálnej centrifugácie sa používa na frakcionáciu buniek, t.j. stratifikáciu ich obsahu do frakcií v závislosti od špecifickej hmotnosti rôznych organel a bunkových inklúzií. Na tento účel sa jemne mleté bunky otáčajú v špeciálnom zariadení - ultracentrifúge. V dôsledku centrifugácie sa zložky buniek vyzrážajú z roztoku a usporiadajú sa v súlade s ich hustotou. Husté štruktúry sa usadzujú pri nižších rýchlostiach odstreďovania, zatiaľ čo menej husté štruktúry sa usadzujú pri vysokých rýchlostiach odstreďovania. Výsledné vrstvy sa oddelia a študujú oddelene.

Centrifugácia v botanike a fyziológii rastlín Centrifugácia umožňuje získať rôzne frakcie subcelulárnych častíc a študovať vlastnosti a funkcie každej frakcie samostatne. Napríklad chloroplasty možno izolovať z listov špenátu, zmyť z bunkových fragmentov opakovaným odstreďovaním vo vhodnom médiu a študovať ich správanie v rôznych experimentálnych podmienkach alebo určiť ich chemické zloženie. Ďalej je možné pomocou rôznych modifikácií techniky tieto plastidy zničiť a izolovať ich základné prvky pomocou diferenciálnej centrifugácie (opakovaná sedimentácia častíc pri rôznych hodnotách zrýchlenia). Týmto spôsobom bolo možné ukázať, že plastidy obsahujú štruktúry, ktoré sa vyznačujú veľmi usporiadanou štruktúrou - takzvané grana; všetky grana sú v membráne obmedzujúcej chloroplast (chloroplastový obal). Výhody tejto metódy sú jednoducho neoceniteľné, pretože umožňuje odhaliť existenciu funkčných podjednotiek, ktoré sú súčasťou väčších subcelulárnych častíc; najmä pomocou metódy diferenciálneho odstreďovania bolo možné preukázať, že grana sú hlavným štruktúrnym prvkom chloroplastu.

Centrifugačná metóda vo virológii Metódu Brackeho hustotného gradientu centrifugácie možno použiť na izoláciu aj kvantitatívnu charakterizáciu rastlinných vírusov. Ako sa ukázalo, táto metóda je plná mnohých možností a v súčasnosti je široko používaná v oblasti virológie a molekulárnej biológie. Pri vykonávaní štúdií centrifugáciou v hustotnom gradiente je centrifugačná skúmavka čiastočne naplnená roztokom, ktorého hustota klesá v smere od dna k menisku. Sacharóza sa najčastejšie používa na vytvorenie gradientu pri frakcionácii rastlinných vírusov. Pred začatím centrifugácie môžu byť vírusové častice buď distribuované v roztoku alebo aplikované na vrchol gradientu. Brakke navrhol tri rôzne techniky centrifugácie v hustotnom gradiente. Pri izotopickej (rovnovážnej) centrifugácii proces pokračuje, kým všetky častice v gradiente nedosiahnu úroveň, pri ktorej sa hustota média rovná ich vlastnej hustote. K frakcionácii častíc teda v tomto prípade dochádza podľa rozdielov v ich hustote. Roztoky sacharózy nemajú dostatočnú hustotu na izopyknálnu separáciu mnohých vírusov. Pri vysokorýchlostnej zónovej centrifugácii sa vírus najskôr aplikuje na vopred vytvorený gradient. Častice každého typu sedimentujú, pričom cez gradient vo forme zóny alebo pásu rýchlosťou závisiacou od ich veľkosti, tvaru a hustoty. Odstreďovanie sa potom ukončí, keď častice stále pokračujú v sedimentácii. Rovnovážna zónová centrifugácia je podobná vysokorýchlostnej zónovej centrifugácii, ale v tomto prípade centrifugácia pokračuje, kým sa nedosiahne izopyknálny stav. Úlohou hustotného gradientu pri vysokorýchlostnej centrifugácii je zabrániť konvekcii a fixovať rôzne typy molekúl v určitých zónach. Teória centrifugácie s hustotným gradientom je zložitá a nie je dobre pochopená. V praxi ide o jednoduchú a elegantnú metódu, ktorá má široké využitie pri práci s rastlinnými vírusmi.

Ťažkosti pri použití metódy centrifugácie Použitie metódy diferenciálnej centrifugácie je spojené s mnohými metodologickými ťažkosťami. Po prvé, keď sú častice izolované, ich štruktúra môže byť poškodená. Preto bolo potrebné vyvinúť špeciálne metódy deštrukcie buniek, ktoré by nespôsobili poškodenie štruktúry subcelulárnych frakcií. Po druhé, keďže subcelulárne častice majú membrány, počas ich uvoľňovania môžu nastať rôzne osmotické účinky. Následne, aby nedošlo k deštrukcii ultraštruktúry skúmaných objektov ani pri ich izolácii, je potrebné starostlivo vybrať zloženie média, v ktorom sa bunky ničia a častice vyzrážajú. A napokon premytím subcelulárnych častíc (ich resuspendovaním v médiu a následnou centrifugáciou) môže dôjsť k strate niektorých látok v nich obsiahnutých, ktoré pôsobením difúznych síl prechádzajú do roztoku. V tomto ohľade je niekedy ťažké pochopiť, ktoré z malých molekúl sú skutočne prvkami skúmaných štruktúr a ktoré boli jednoducho adsorbované ich povrchom počas procesu izolácie. Táto situácia sťažuje presné určenie niektorých funkčných vlastností vybraných objektov.

Centrifugácia Ide o separáciu mechanických zmesí na ich zložky.
pôsobením odstredivej sily. Nástroje používané na tento účel
terče sa nazývajú centrifúgy.
Hlavnou časťou odstredivky je rotor s namontovaným v
hniezdi pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča s
vysoká rýchlosť, čo má za následok významné
veľkosť odstredivej sily, pod vplyvom ktorej
mechanické zmesi sa separujú napr
sedimentácia častíc suspendovaných v kvapaline.

Procesy prebiehajúce v odstredivke

Centrifúgy zdieľajú nasledujúce procesy:
1) Odstredivá filtrácia.
2) Odstredivé usadzovanie.
3) Odstredivé čírenie.

odstredivá filtrácia

Odstredivá filtrácia je
proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s
perforované bubny. Vnútorný povrch
takéhoto bubna je pokrytý filtračnou tkaninou.
Záves je vrhnutý odstredivou silou smerom k
steny bubna, zatiaľ čo tuhá fáza zostáva zapnutá
povrch tkaniva a pôsobená kvapalina
odstredivá sila prechádza vrstvou sedimentu a
tkanina sa odoberá von cez otvory v bubne.
Odstredivá filtrácia zvyčajne pozostáva z
tri po sebe idúce fyzikálne procesy:
1) filtrácia s tvorbou zrazeniny;
2) zhutnenie sedimentu;
3) odstránenie zadržanej kvapaliny zo sedimentu
molekulárne sily;

odstredivé usadzovanie

odstredivé usadzovanie
Odstredivé usadzovanie - separačný proces
suspenzie v odstredivkách s bubnami
pevné steny. Suspenzia sa vstrekuje do spodnej časti
časti bubna a pri pôsobení odstredivej sily
hodené o steny. Steny tvoria vrstvu
sediment, a kvapalina tvorí vnútornú vrstvu a
vytlačené z bubna vstupujúceho do separácie
pozastavenie. Kvapalina stúpa nahor
naleje cez okraj bubna a odstráni sa
von.
V tomto prípade prebiehajú dva fyzikálne procesy:
1) Depozícia tuhej fázy.
2) Zhutnenie sedimentu.

Odstredivé čírenie

Odstredivé čírenie - separačný proces
riedke suspenzie a koloidné roztoky. Takže
to isté sa vykonáva v pevných bubnoch.
Fyzikálne, odstredivé
objasnenie je proces
voľné usadzovanie pevných častíc v teréne
odstredivé sily.
V bubnoch s pevnými stenami
tiež sa vykonáva separácia emulzií. Pod
pôsobenie zložiek odstredivej sily
emulzie podľa hustoty
umiestnené vo forme ohraničených vrstiev:
vonkajšia vrstva kvapaliny s vyššou hustotou
a vnútorná vrstva svetlejšej kvapaliny.
Kvapaliny sa vypúšťajú z bubna oddelene.

V klinických a sanitárnych laboratóriách
použitie odstreďovania
na oddelenie erytrocytov od
krvná plazma, krvné zrazeniny
sérum, husté častice z
tekutá časť moču a pod
na tento účel, príp
ručné odstredivky, príp
elektrické odstredivky,
ktorého rýchlosť otáčania
možno upraviť.
Ultracentrifúgy, rýchlosť
rotácia rotorov ktorej
presahuje 40 000 otáčok za minútu,
zvyčajne sa používa v
experimentálna prax
na oddelenie organel
bunky, separácia koloid
častice, makromolekuly,
polyméry.

Využitie centrifugácie v parazitológii

Metóda sa používa na odlíšenie komplexu
krvnej zmesi, moču alebo výkalov a následne
izolácia helmintov z nej na ďalšie
vyšetrenie pod mikroskopom a fixácia materiálu. AT
centrifugačný proces dostupný vo vzorke
parazity prechádzajú cez filter a hromadia sa v
spodná kužeľová priehradka rúrky. Filtračná sieť
s bunkami špeciálnej veľkosti
v skúmavke je v dôsledku toho umiestnená vertikálne
čo sa stane horizontálne (laterálne)
filtrácia vzorky. V dôsledku toho drsné
častice nestrávenej potravy sa ukladajú vláknina
miešacej komory a parazitov a ich vajíčok
voľne prejsť cez filter. Takže
Parazity sa teda koncentrujú v
povrchová vrstva jemného sedimentu, a
laboratórny lekár môže len starostlivo vyberať
vzorka na mikroskopiu s
automatickú pipetu a naneste ju na
šmykľavka.

Centrifugačná metóda v cytológii

Diferenciálna metóda
sa používa odstreďovanie
frakcionácia buniek, teda ich stratifikácia
obsah na zlomky v závislosti od špecif
hmotnosť rôznych organel a bunkových inklúzií.
Na tento účel sa jemne rozdelené bunky otáčajú dovnútra
špeciálny prístroj - ultracentrifúga. AT
ako výsledok centrifugácie, bunkové zložky
zrazenina z roztoku, usadzovanie sa
podľa jeho hustoty. Viac hustejšie
štruktúry sa ukladajú pri nižších rýchlostiach
odstreďovanie a menej husté - pri vysokej
rýchlosti. Výsledné vrstvy sa oddelia a študujú
oddelene.

10. Centrifugácia v botanike a fyziológii rastlín

Centrifugácia umožňuje získať rôzne
frakcie subcelulárnych častíc a preskúmať
vlastnosti a funkcie každej frakcie v
oddelene. Napríklad zo špenátových listov môžete
izolujte chloroplasty, umyte ich
opätovná centrifugácia vo vhodnom
médium z bunkových fragmentov a skúmajte ich
správanie v rôznych experimentálnych
podmienok alebo určiť ich chemické zloženie.
Ďalej je to možné použitím rôznych modifikácií
techniky, zničte tieto plastidy a izolujte
cez
diferenciálna centrifugácia (opakovane).
ukladanie častíc v rôznych hodnotách
zrýchlenie) ich základné prvky. Takže
tým bolo možné ukázať, že plastidy obsahujú
štruktúry, ktoré sú vysoko usporiadané
štruktúra, - takzvané zrná; všetky zrná
sú vo vnútri ohraničujúceho chloroplastu
membrány (membrána chloroplastu). Výhody
Táto metóda je jednoducho neoceniteľná, pretože to
odhaľuje existenciu
funkčné podjednotky, ktoré tvoria
väčšie subcelulárne častice; najmä
pomocou metódy

11. Centrifugačná metóda vo virológii

Metóda odstreďovania s gradientom hustoty Brakke môže byť
použiť na výber aj akvizíciu
kvantitatívne charakteristiky rastlinných vírusov. Ako sa ukázalo,
Táto metóda je plná mnohých možností a v súčasnosti je
široko používané v oblasti virológie a molekulárnej
biológia. Pri vykonávaní výskumu metódou
hustotná centrifugácia centrifugačná skúmavka
čiastočne naplnený roztokom, ktorého hustota klesá v
smerom zdola k menisku. Na vytvorenie gradientu
najčastejšie sa používa frakcionácia rastlinných vírusov
sacharóza. Pred začatím centrifugácie môžu vírusové častice
buď distribuovaný v celom objeme roztoku, alebo aplikovaný na
vrchol gradientu. Brakke navrhol tri rôzne metódy
centrifugácia v hustotnom gradiente. Pri izotypickom
(rovnovážny) proces odstreďovania pokračuje až do
kým všetky častice v gradiente nedosiahnu úroveň, kde je hustota
médium sa rovná ich vlastnej hustote. Touto cestou,
frakcionácia častíc nastáva v tomto prípade v súlade s
rozdiely v ich hustote. Roztoky sacharózy nemajú
dostatočná hustota na izopyknálnu separáciu mnohých
vírusy. Pri vysokorýchlostnej zónovej centrifugácii sa vírus
najprv aplikovaný na predtým vytvorený gradient. Častice
sediment každého typu súčasne cez gradient vo forme zóny,
alebo pásiky, rýchlosťou v závislosti od ich veľkosti, tvaru a
hustota. Odstreďovanie sa ukončí, keď sa častice
naďalej sedimentovať. Rovnováha zonálna
centrifugácia podobná rýchlostnej zónovej
odstreďovanie, ale v tomto prípade odstreďovanie

12. Ťažkosti pri použití metódy odstreďovania

Aplikácia metódy diferenciálnej centrifugácie
s mnohými metodickými ťažkosťami. Najprv o
uvoľnenie častíc môže poškodiť ich štruktúru. Preto
bolo potrebné vyvinúť špeciálne metódy na ničenie buniek,
ktoré by nespôsobili poškodenie štruktúry subcelulárneho
zlomky. Po druhé, keďže subcelulárne častice majú
membrány v procese ich uvoľňovania,
rôzne osmotické účinky. Preto za to
aby nedošlo k zničeniu ultraštruktúry skúmaných objektov
aj keď sú izolované, je potrebné starostlivo vybrať zloženie
prostredie, v ktorom dochádza k deštrukcii buniek a usadzovaniu
častice. A nakoniec umývanie subcelulárnych častíc
(opätovne ich suspendujte v médiu a potom znova
centrifugácia) môže viesť k strate niektorých
látky v nich obsiahnuté, ktoré pôsobením difúznych síl
ísť do riešenia.
V tomto ohľade je niekedy ťažké pochopiť, ktorá z malých molekúl
sú skutočne prvkami skúmaných štruktúr a ktoré
boli jednoducho adsorbované na ich povrchu počas procesu izolácie.
Táto situácia sťažuje určenie niektorých
funkčné vlastnosti vybraných objektov.

Práca na kurze

odstreďovanie

1. Princíp metódy

Separácia látok odstreďovaním je založená na rozdielnom správaní častíc v odstredivom poli. Suspenzia častíc umiestnená v skúmavke sa vloží do rotora namontovaného na hnacom hriadeli odstredivky.

V odstredivom poli sa častice s rôznymi hustotami, tvarmi alebo veľkosťami ukladajú rôznymi rýchlosťami. Rýchlosť sedimentácie závisí ododstredivé zrýchleniepriamo úmerné uhlovej rýchlosti rotora a vzdialenosti medzi časticou a osou rotácie:

a odstredivé zrýchlenie potom bude

Od jednej otáčky rotora je2p radiánov, uhlovú rýchlosť rotora v otáčkach za minútu možno zapísať ako:

Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkáchg a volalrelatívne odstredivé zrýchlenie , t.j.

alebo

Pri uvádzaní podmienok oddeľovania častíc uveďte rýchlosť otáčania a polomer rotora, ako aj čas odstreďovania. Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkáchg , vypočítané z priemerného polomeru otáčania stĺpca kvapalinyvcentrifugačná skúmavka. Dole a Kotzias na základe rovnice zostavili nomogram vyjadrujúci závislosť GCF od rýchlosti rotora a polomeru r.

Ryža. 2 .1. Nomogram na výpočet odstredivého zrýchlenia.

Na určenie O sú hodnoty polomeru a rýchlosti otáčania rotora na extrémnych mierkach spojené priamkou; priesečník tejto priamky s priemernou stupnicou udáva požadovanú hodnotu odstredivého zrýchlenia. Treba mať na pamäti, že pravý stĺpec čísel na stupnici O zodpovedá pravému stĺpcu čísel stupnice otáčok rotora; vľavo - vľavo.

Rýchlosť sedimentácie guľovitých častíc závisí nielen od odstredivého zrýchlenia, ale aj od hustoty a polomeru samotných častíc a od viskozity suspenzného média. Čas potrebný na sedimentáciu guľovej častice v kvapalnom médiu z tekutého menisku na dno centrifugačnej skúmavky je nepriamo úmerný rýchlosti sedimentácie a je určený nasledujúcou rovnicou:

kdet - čas sedimentácie v sekundách,rj- viskozita média,Gh- polomer častice, rh- hustota častíc, p - stredná hustota, gm- vzdialenosť od osi otáčania k menisku tekutiny, gd- vzdialenosť od osi otáčania k spodnej časti rúrky.

Ako vyplýva z rovnice, pri danej rýchlosti rotora je čas potrebný na sedimentáciu homogénnych guľových častíc nepriamo úmerný druhej mocnine ich polomerov a rozdielu hustôt častíc a média a je priamo úmerný viskozite média. . Preto je možné oddeliť zmes heterogénnych, približne guľovitých častíc, ktoré sa líšia hustotou a veľkosťou, buď v dôsledku rôznych časov ich usadzovania na dne skúmavky pri danom zrýchlení, alebo v dôsledku distribúcie sedimentujúcich častíc pozdĺž trubice. , ktorý sa zakladá po určitom čase. Pri oddeľovaní látok je potrebné brať do úvahy také dôležité faktory, ako je hustota a viskozita média. Opísané spôsoby môžu oddeliť bunkové organely od tkanivových homogenátov. Hlavné zložky bunky sú uložené v nasledujúcom poradí: najprv celé bunky a ich fragmenty, potom jadrá, chloroplasty, mitochondrie, lyzozómy, mikrozómy a nakoniec ribozómy. Usadzovanie neguľových častíc nie je v súlade s rovnicou, takže častice rovnakej hmotnosti, ale rôznych tvarov sa ukladajú rôznymi rýchlosťami. Táto vlastnosť sa využíva v štúdii pomocou ultracentrifugácie konformácie makromolekúl.

spočíva v prideľovaní biologického materiálu pre následné biochemické štúdie. V tomto prípade sa môžu odobrať veľké množstvá počiatočného biologického materiálu, napríklad inokulácie mikrobiálnych buniek zo vsádzkových alebo kontinuálnych kultúr, ako aj inokulácie rastlinných a živočíšnych buniek z kultúr tkanív a krvnej plazmy. Pomocou preparatívnej centrifugácie sa izoluje veľké množstvo bunkových častíc na štúdium ich morfológie, štruktúry a biologickej aktivity. Spôsob sa tiež používa na izoláciu takých biologických makromolekúl, ako je DNA a proteíny, z predtým purifikovaných prípravkov.

Analytická centrifugácia Používa sa najmä na štúdium čistých alebo prakticky čistých prípravkov makromolekúl alebo častíc, ako sú ribozómy. V tomto prípade sa používa malé množstvo materiálu a sedimentácia študovaných častíc sa nepretržite zaznamenáva pomocou špeciálnych optických systémov. Metóda umožňuje získať údaje o čistote, molekulovej hmotnosti a štruktúre materiálu. V pregraduálnych workshopoch sa preparatívna centrifugácia používa oveľa častejšie ako analytická, preto sa jej budeme venovať podrobnejšie, hoci obe metódy sú založené na spoločných princípoch.

2. Preparatívna centrifugácia

2 .1 Diferenciálne odstreďovanie

Táto metóda je založená na rozdieloch v rýchlostiach sedimentácie častíc, ktoré sa navzájom líšia veľkosťou a hustotou. Materiál, ktorý sa má oddeliť, napríklad tkanivový homogenát, sa odstreďuje s postupným zvyšovaním odstredivého zrýchlenia, ktoré sa volí tak, že v každom štádiu sa určitá frakcia usadí na dne skúmavky. Na konci každého kroku sa zrazenina oddelí od supernatantu a niekoľkokrát sa premyje, aby sa nakoniec získala čistá vyzrážaná frakcia. Bohužiaľ je prakticky nemožné získať absolútne čistú zrazeninu; Aby sme pochopili, prečo sa to deje, pozrime sa na proces, ktorý sa vyskytuje v centrifugačnej skúmavke na začiatku každého kroku centrifugácie.

Po prvé, všetky častice homogenátu sú rovnomerne rozložené po celom objeme centrifugačnej skúmavky, takže nie je možné získať čisté prípravky precipitátov najťažších častíc v jednom cykle centrifugácie: prvá vytvorená zrazenina obsahuje hlavne najťažšie častice, ale okrem toho aj určité množstvo všetkých počiatočných zložiek. Dostatočne čistý prípravok ťažkých častíc možno získať iba resuspendovaním a odstredením počiatočnej zrazeniny. Ďalšie odstreďovanie supernatantu s následným zvýšením odstredivého zrýchlenia vedie k sedimentácii častíc strednej veľkosti a hustoty a následne k sedimentácii najmenších častíc s najnižšou hustotou. Na obr. 2.3 je diagram frakcionácie homogenátu pečene potkana.

Ryža. 2.2. Diferenciálna centrifugácia suspenzie častíc v odstredivom poli.

Najprv sa častice rovnomerne rozložia po celom objeme centrifugačnej skúmavky. (a): počas odstreďovania častice sedimentujú podľa ich veľkosti a tvaru (b - e).

Ryža. 2.3. Schéma frakcionácie homogenátu pečene potkana na subcelulárne frakcie.

Zdá sa, že diferenciálna centrifugácia je najbežnejšou metódou izolácie bunkových organel z tkanivových homogenátov. Táto metóda sa najúspešnejšie používa na oddelenie takých bunkových organel, ktoré sa navzájom výrazne líšia veľkosťou a hustotou. Ale ani v tomto prípade nie sú získané frakcie nikdy absolútne homogénne a na ich ďalšiu separáciu sa používajú iné metódy, ktoré sú popísané nižšie. Tieto metódy, založené na rozdieloch v hustote organel, poskytujú efektívnejšiu separáciu odstreďovaním v roztokoch s kontinuálnym alebo stupňovitým gradientom hustoty. Nevýhodou týchto metód je, že získanie hustotného gradientu roztoku si vyžaduje čas.

2.2 Odstreďovanie so zónovou rýchlosťou

Metóda zónovej rýchlosti, alebo, ako sa tiež nazýva,s-zonálna centrifugácia, spočíva vo vrstvení testovanej vzorky na povrchu roztoku s kontinuálnym hustotným gradientom. Vzorka sa potom odstreďuje, kým sa častice nerozdelia pozdĺž gradientu v diskrétnych zónach alebo pásoch. Vytvorením gradientu hustoty je možné vyhnúť sa zmiešaniu zón, ktoré sú výsledkom konvekcie. Metóda rýchlostnej zónovej centrifugácie sa používa na oddelenie hybridov RNA-DNA, podjednotiek ribozómov a iných bunkových zložiek.

Ryža. 2 .4. Rýchlosť a izopyknálna separácia častíc v hustotnom gradiente. Pred začatím centrifugácie sa suspenzia častíc navrství na gradient hustoty kvapaliny (a). Pri vysokorýchlostnej centrifugácii častice nedosiahnu izopyknálny bod a pri izopyknálnej separácii sa v odstreďovaní pokračuje dovtedy, kým študované častice nedosiahnu zónu so zodpovedajúcou hustotou. (b).

2.3 Izopyknické odstreďovanie

Izopyknické odstreďovanie sa uskutočňuje v hustotnom gradiente aj obvyklým spôsobom. Ak sa odstreďovanie neuskutočňuje v hustotnom gradiente, prípravok sa najskôr odstredí tak, aby sa usadili častice s molekulovou hmotnosťou vyššou ako majú skúmané častice. Tieto ťažké častice sa odstránia a vzorka sa suspenduje v médiu, ktorého hustota je rovnaká ako hustota frakcie, ktorá sa má izolovať, a potom sa odstreďuje, kým sa skúmané častice neusadia na dne skúmavky a častice s nižšou hustotou plávajú na povrch kvapaliny...

Ryža. 2.5. Izopyknálna separácia bez hustotného gradientu.

Pred centrifugáciou sa častice rovnomerne rozložia po celom objeme centrifugačnej skúmavky (a). Po odstredení ľahšie častice plávajú nahor, zatiaľ čo ťažké častice sa usadzujú na dne skúmavky. (b)

Ďalším spôsobom je vrstvenie vzorky na povrch roztoku s kontinuálnym hustotným gradientom pokrývajúcim rozsah hustôt všetkých zložiek zmesi. Odstreďovanie sa vykonáva dovtedy, kým sa hustota častíc nerovná hustote zodpovedajúcich zón, t.j. kým sa častice nerozdelia do zón. Metóda sa nazýva zonálna izopyknická alebo rezonančná centrifugácia, pretože hlavným bodom je tu vztlaková hustota a nie veľkosť alebo tvar častíc. Množstvo hustoty, pri ktorej častice tvoria izopyknálne pásy, je ovplyvnené povahou suspenzného média; častice môžu byť priepustné pre niektoré zlúčeniny v roztoku a nepriepustné pre iné, alebo môžu pripájať molekuly roztoku. Pri použití zonálneho rotora sa mitochondrie, lyzozómy, peroxizómy a mikrozómy koncentrujú v pásoch so 42 %, 47 %, 47 % a 27 % sacharózy, čo zodpovedá hustote 1,18, 1,21, 1,21 a 1,10 g-cm-3 resp. Hustota subcelulárnych organel závisí aj od ich selektívneho príjmu určitých zlúčenín. Zavedenie nehemolytického detergentu Triton potkanomWR-1339 vedie k zvýšeniu veľkosti a zníženiu hustoty pečeňových lyzozómov; hustota mitochondrií a peroxizómov zostáva nezmenená. Napriek tomu, že sedimentačné vlastnosti lyzozómov sa spravidla nemenia, ich rovnovážna hustota v gradiente sacharózy klesá z 1,21 na 1,1, čo vedie k zodpovedajúcej separácii lyzozomálno-peroxizomálnej frakcie. Táto vlastnosť sa využíva pri kvantitatívnej separácii lyzozómov, mitochondrií a peroxizómov na základe odstránenia všetkých častíc s hustotou väčšou ako je hustota mikrozómov z homogénneho média a následnej izopyknálnej centrifugácie vyzrážaných ťažkých častíc.

2.4 Odstreďovanie s gradientom rovnovážnej hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa používajú soli ťažkých kovov, ako je rubídium alebo cézium, ako aj roztoky sacharózy. Vzorka, ako je DNA, sa zmieša s koncentrovaným roztokom chloridu cézneho. Rozpustená látka aj rozpúšťadlo sú na začiatku rovnomerne distribuované v celom objeme. Počas odstreďovania sa ustanoví rovnovážna distribúcia koncentrácie a následne hustotyCsCl, keďže cézne ióny majú veľkú hmotnosť. Pôsobením odstredivého zrýchlenia sa molekuly DNA redistribuujú a zhromažďujú sa vo forme oddelenej zóny v časti skúmavky s hustotou zodpovedajúcou im. Metóda sa používa hlavne pri analytickej centrifugácii a použili ju Meselson a Stahl na štúdium mechanizmu replikácie DNA.E. coli . Odstreďovanie s rovnovážnym hustotným gradientom je tiež jednou z metód separácie a štúdia lipoproteínov ľudskej plazmy.

2. 5 Tvarovanie a extrakcia gradientov

2.5.1 Povaha gradientov

Na vytvorenie hustotných gradientov roztokov sa najčastejšie používajú roztoky sacharózy, niekedy s pevným pH. V niektorých prípadoch sa dosiahne dobrá separácia, keď sa použije namiesto obyčajnej vody.D2 0. V tabuľke. 2.1 sú uvedené vlastnosti niektorých roztokov sacharózy.

Koncentrácia, %

Vlastnosti roztokov sacharózy

Voľba gradientu je daná špecifickými úlohami frakcionácie. Takže napríklad fikol, vyrábaný firmouPharmacia Dobre Chemikálie, môže nahradiť sacharózu v prípadoch, keď je potrebné vytvoriť gradienty s vysokou hustotou a nízkym osmotickým tlakom. Ďalšou výhodou ficol je, že neprechádza cez bunkové membrány. Soli ťažkých kovov, ako je rubídium a cézium, sa používajú na vytváranie gradientov vyššej hustoty, avšak kvôli korozívnemu účinkuCsCltakéto gradienty sa používajú iba v rotoroch vyrobených z odolných kovov, ako je titán.

2.5.2 Technika stupňovitého gradientu hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa niekoľko roztokov s postupne klesajúcou hustotou opatrne zavedie do centrifugačnej skúmavky pomocou pipety. Potom sa na najvrchnejšiu vrstvu, ktorá má najnižšiu hustotu, navrství vzorka vo forme úzkej zóny, po ktorej sa skúmavka odstredí. Hladké lineárne gradienty možno získať vyhladzovaním postupných gradientov počas dlhšieho státia roztoku. Proces je možné urýchliť jemným premiešaním obsahu skúmavky drôtom alebo jemným potrasením skúmavky.

2.5.3 Technika vytvárania hladkého gradientu hustoty

Vo väčšine prípadov sa na vytvorenie hladkého gradientu hustoty používa špeciálne zariadenie. Skladá sa z dvoch valcových nádob presne definovaného identického priemeru, navzájom komunikujúcich na dne sklenenou trubicou s regulačným ventilom, čo umožňuje nastaviť pomery, v ktorých sa obsah oboch nádob mieša. Jedna z nich je vybavená miešadlom a má výstup, ktorým roztok prúdi do centrifugačných skúmaviek. Hustší roztok sa umiestni do mixéra; druhý valec je naplnený roztokom nižšej hustoty. Výška stĺpca roztokov v oboch valcoch je nastavená tak, aby hydrostatický tlak v nich bol rovnaký. Hustší roztok sa postupne uvoľňuje z mixéra do skúmaviek odstredivky a súčasne sa nahrádza rovnakým objemom roztoku s nižšou hustotou vstupujúceho do mixéra z druhého valca cez riadiaci ventil. Homogenita roztoku v miešačke je zabezpečená neustálym miešaním roztoku pomocou miešadla. Keď je roztok odvádzaný do centrifugačných skúmaviek, jeho hustota klesá a v skúmavkách sa vytvára lineárny gradient hustoty. Nelineárne gradienty môžu byť vytvorené pomocou systému pozostávajúceho z dvoch valcov nerovnakého priemeru.

Na vytváranie hustotných gradientov rôznej strmosti sa používa systém dvoch mechanicky ovládaných striekačiek, ktoré sú naplnené roztokmi s nerovnakou hustotou. Zmenou relatívnej rýchlosti piestov možno vytvoriť rôzne gradienty.

2.5.4 Extrakcia gradientov z centrifugačných skúmaviek

Po dokončení odstreďovania a oddelení častíc musia byť vytvorené zóny odstránené. Robí sa to niekoľkými spôsobmi, najčastejšie metódou posunu. Na základni sa prepichne centrifugačná skúmavka a do jej spodnej časti sa pomaly zavedie veľmi husté médium, napríklad 60-70% roztok sacharózy. Roztok na vrchu sa vytlačí a frakcie sa odoberú pomocou injekčnej striekačky, pipety alebo špeciálneho zariadenia pripojeného cez hadičku k zberaču frakcií. Ak sú rúrky vyrobené z celuloidu alebo nitrocelulózy, frakcie sa extrahujú rezaním rúrky špeciálnou čepeľou. Za týmto účelom sa centrifugačná skúmavka upevnená v stojane nareže priamo pod želanou zónou a frakcia sa odsaje injekčnou striekačkou alebo pipetou. Pri vhodnej konštrukcii rezacieho zariadenia bude strata roztoku minimálna. Zber frakcií sa tiež uskutočňuje prepichnutím dna skúmavky tenkou dutou ihlou. Kvapky vytekajúce zo skúmavky cez ihlu sa zachytávajú v zberači frakcií na ďalšiu analýzu.

2.5.5 Preparatívne centrifúgy a ich aplikácie

Preparatívne centrifúgy možno rozdeliť do troch hlavných skupín: centrifúgy na všeobecné použitie, vysokorýchlostné centrifúgy a preparatívne ultracentrifúgy.Odstredivky na všeobecné použitie dajte maximálnu rýchlosť 6000 ot./min-1 a OCU do 6000g . Líšia sa od seba iba kapacitou a majú množstvo vymeniteľných rotorov: hranaté a so závesnými okuliarmi. Jednou z vlastností tohto typu centrifúg je ich veľká kapacita - od 4 do 6 dm3 , ktorá umožňuje ich naplnenie nielen 10,50 a 100 cm centrifugačnými skúmavkami3 , ale aj nádoby s objemom do 1,25 dm3 . Vo všetkých centrifúgach tohto typu sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli a rúrky centrifúgy spolu s ich obsahom musia byť starostlivo vyvážené a musia sa líšiť v hmotnosti nie viac ako 0,25 g, mali by byť umiestnené symetricky, jedna proti sebe. iné, čím sa zabezpečí rovnomerné rozloženie skúmaviek vzhľadom na os otáčania rotora.

Vysokorýchlostné odstredivky dať maximálnu rýchlosť 25 000 ot./min-1 a OCU do 89 000g. Komora rotora je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje zahrievaniu, ku ktorému dochádza v dôsledku trenia počas otáčania rotora. Vysokorýchlostné odstredivky majú spravidla kapacitu 1,5 dm3 a sú vybavené vymeniteľnými rotormi, uhlovými aj so závesnými sklami.

Preparatívne ultracentrifúgy poskytujú maximálnu rýchlosť až 75 000 ot./min-1 a maximálne odstredivé zrýchlenie 510 000g . Sú vybavené chladničkou aj vákuovou jednotkou, aby nedochádzalo k prehrievaniu rotora v dôsledku jeho trenia o vzduch. Rotory takýchto centrifúg sú vyrobené z vysokopevnostného hliníka alebo zliatin titánu. Používajú sa hlavne rotory z hliníkovej zliatiny, avšak v prípadoch, kde sa vyžadujú obzvlášť vysoké otáčky, sa používajú rotory z titánu. Na zníženie vibrácií spôsobených nevyváženosťou rotora v dôsledku nerovnomerného plnenia centrifugačných skúmaviek majú ultracentrifúgy ohybný hriadeľ. Skúmavky centrifúgy a ich obsah musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na 0,1 g. Podobné požiadavky by sa mali dodržiavať aj pri plnení rotorov centrifúg na všeobecné použitie.

2.6 Konštrukcia rotorov

2.6.1 Uhlové rotory a rotory so závesnými vedrami

Rotory preparatívnych centrifúg sú zvyčajne dvojakého typu - uhlové a závesné vedrá. Nazývajú sa uhlové, pretože odstredivkové trubice v nich umiestnené sú vždy v určitom uhle k osi otáčania. V rotoroch so závesnými okuliarmi sú skúmavky inštalované vertikálne a pri otáčaní pôsobením vznikajúcej odstredivej sily sa pohybujú do horizontálnej polohy; uhol sklonu k osi otáčania je 90°.

V uhlových rotoroch je vzdialenosť, ktorú prejdú častice k zodpovedajúcej stene skúmavky, veľmi malá, a preto k sedimentácii dochádza pomerne rýchlo. Po zrážke so stenami skúmavky častice skĺznu dolu a na dne vytvoria sediment. Pri odstreďovaní vznikajú konvekčné prúdy, ktoré značne komplikujú separáciu častíc s podobnými sedimentačnými vlastnosťami. Napriek tomu sa rotory podobnej konštrukcie úspešne používajú na separáciu častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie sa značne líši.

V rotoroch s visiacimi pohármi sa tiež pozorujú konvekčné javy, ale nie sú také výrazné. Konvekcia je výsledkom skutočnosti, že pri pôsobení odstredivého zrýchlenia sa častice usadzujú v smere, ktorý nie je striktne kolmý na os rotácie, a preto, ako pri uhlových rotoroch, narážajú na steny skúmavky a skĺznu do dno.

Efektom konvekcie a vírenia je možné do určitej miery zabrániť použitím sektorovo tvarovaných rúrok v rotoroch so závesnými miskami a nastavením rýchlosti rotora; vyššie uvedené, je spôsob odstreďovania v hustotnom gradiente tiež zbavený nevýhod.

2.6.2 Priebežné rotory

Kontinuálne rotory sú určené na vysokorýchlostnú frakcionáciu relatívne malých množstiev pevného materiálu z veľkoobjemových suspenzií, napríklad na izoláciu buniek z kultivačných médií. Počas odstreďovania sa do rotora kontinuálne pridáva suspenzia častíc; Priepustnosť rotora závisí od charakteru ukladaného prípravku a pohybuje sa od 100 cm3 do 1 dm3 za 1 min. Zvláštnosťou rotora je, že ide o izolovanú komoru špeciálnej konštrukcie; jeho obsah nekomunikuje s vonkajším prostredím, a preto nie je znečistený ani postriekaný.

2.6.3 Zonálne alebo Andersonove rotory

Ryža. 2 .6. Kroky odstreďovania (a- e) v zónovom rotore

Zonálne rotory sú vyrobené z hliníka alebo zliatin titánu, ktoré sú schopné odolávať veľmi výrazným odstredivým zrýchleniam. Zvyčajne majú valcovú dutinu uzavretú odnímateľným krytom. Vo vnútri dutiny je na osi otáčania axiálna rúrka, na ktorú je nasadená tryska s lopatkami, ktorá rozdeľuje dutinu rotora na štyri sektory. Lopatky alebo usmerňovače majú radiálne kanály, cez ktoré je gradient vstrekovaný z axiálnej rúrky k obvodu rotora. Vďaka tomuto dizajnu lopatiek je konvekcia znížená na minimum.

Plnenie rotora sa vykonáva pri jeho otáčaní rýchlosťou asi 3000 ot./min-1 . Do rotora sa čerpá vopred vytvorený gradient, počnúc vrstvou s najnižšou hustotou, ktorá je rovnomerne rozložená po obvode rotora a je udržiavaná na jeho vonkajšej stene kolmej na os otáčania v dôsledku odstredivej sily.. S následným pridávaním vrstiev s vyšším hustotným gradientom nastáva kontinuálny posun smerom k stredu menej hustých vrstiev. Po načerpaní celého gradientu do rotora sa rotor naplní do svojho plného objemu roztokom nazývaným „vankúš“, ktorého hustota je rovnaká alebo mierne presahuje najvyššiu hustotu vopred vytvoreného gradientu.

Potom sa cez axiálnu trubicu navrství skúšobná vzorka, ktorý je vytlačený z rúrky do objemu rotora pomocou roztoku s nižšou hustotou, súčasne sa z periférie odstráni rovnaký objem „vankúše“. Po všetkých týchto postupoch sa rýchlosť otáčania rotora uvedie na pracovnú rýchlosť a počas požadovaného časového obdobia sa vykonáva buď zonálna rýchlosť alebo zonálna izopyknická frakcionácia.. Extrakcia frakcií sa uskutočňuje pri rýchlosti rotora 3000 ot./min-1 . Obsah rotora sa premiestňuje pridaním „vankúše“ z periférie, najskôr sa premiestnia menej husté vrstvy. Vďaka špeciálnej konštrukcii axiálneho kanála Andersonovho rotora nedochádza k miešaniu zón pri ich premiestňovaní. Odchádzajúci gradient prechádza cez záznamové zariadenie, napríklad spektrofotometrickú celu, pomocou ktorej je možné stanoviť obsah proteínu absorpciou pri 280 nm, alebo cez špeciálny detektor rádioaktivity, po ktorom sa zbierajú frakcie.

Kapacita zónových rotorov používaných pri stredných rýchlostiach sa pohybuje od 650 do 1600 cm3 , čo umožňuje získať pomerne veľké množstvo materiálu. Zonálne rotory sa používajú na odstránenie proteínových kontaminantov z rôznych prípravkov a na izoláciu a čistenie mitochondrií, lyzozómov, polyzómov a proteínov.

2.6.4 Analýza subcelulárnych frakcií

Vlastnosti prípravku subcelulárnych častíc získaných frakcionáciou možno pripísať vlastnostiam samotných častíc iba vtedy, ak prípravok neobsahuje nečistoty. Preto je vždy potrebné hodnotiť čistotu získaných prípravkov. Účinnosť homogenizácie a prítomnosť nečistôt v prípravku možno určiť mikroskopickým vyšetrením. Neprítomnosť viditeľných nečistôt však zatiaľ nie je spoľahlivým dôkazom čistoty drogy. Aby sa kvantifikovala čistota získaného prípravku, je podrobený chemickej analýze, ktorá umožňuje určiť obsah proteínov alebo DNA v ňom, určiť jeho enzymatickú aktivitu, ak je to možné, a imunologické vlastnosti.

Analýza distribúcie enzýmov vo frakcionovaných tkanivách je založená na dvoch všeobecných princípoch. Prvým z nich je, že všetky častice danej subcelulárnej populácie obsahujú rovnakú sadu enzýmov. Druhý predpokladá, že každý enzým je lokalizovaný na nejakom špecifickom mieste v bunke. Ak by bola táto poloha pravdivá, potom by enzýmy mohli pôsobiť ako markery pre zodpovedajúce organely: napríklad cytochrómoxidáza a monoaminooxidáza by slúžili ako mitochondriálne markerové enzýmy, kyslé hydrolázy ako lyzozómové markery, kataláza ako peroxizómový marker a glukóza-6- fosfatáza - marker mikrozomálnej membrány. Ukázalo sa však, že niektoré enzýmy, ako je malátdehydrogenáza,R -glukuronidáza, NADP'H-cytochróm-c-reduktáza, sú lokalizované vo viac ako jednej frakcii. Preto by sa k výberu enzýmov-markerov subcelulárnych frakcií v každom konkrétnom prípade malo pristupovať veľmi opatrne. Okrem toho neprítomnosť markerového enzýmu neznamená absenciu zodpovedajúcich organel. Je pravdepodobné, že počas frakcionácie sa enzým stratí organelami alebo je inhibovaný alebo inaktivovaný; preto sa pre každú frakciu zvyčajne stanovujú aspoň dva markerové enzýmy.

Zlomok

2.7 Frakcionácia diferenciálnym odstreďovaním

2.7.1 Prezentácia výsledkov

Výsledky získané z frakcionácie tkaniva sú najvhodnejšie prezentované vo forme grafov. Pri štúdiu distribúcie enzýmov v tkanivách je teda najlepšie prezentovať údaje vo forme histogramov, ktoré umožňujú vizuálne vyhodnotiť výsledky experimentov.

Enzymatická aktivita obsahu bielkovín vo vzorke sa zisťuje ako v pôvodnom homogenáte, tak aj v každej izolovanej subcelulárnej frakcii samostatne. Celková enzymatická aktivita a obsah bielkovín vo frakciách by sa nemali výrazne líšiť od zodpovedajúcich hodnôt v pôvodnom homogenáte.

Potom sa vypočíta enzymatická aktivita a obsah proteínu v každej frakcii v % z celkového výťažku, na základe čoho sa urobí histogram. Relatívne množstvo proteínu v každej frakcii je postupne vynesené pozdĺž osi x v poradí ich izolácie a relatívna špecifická aktivita každej frakcie je vynesená pozdĺž osi y. Enzymatická aktivita každej frakcie sa teda určuje z plochy stĺpcov.

2.7.2 Analytická ultracentrifugácia

Na rozdiel od preparatívnej centrifugácie, ktorej účelom je separovať látky a čistiť ich, analytická ultracentrifugácia sa používa najmä na štúdium sedimentačných vlastností biologických makromolekúl a iných štruktúr. Preto sa pri analytickej centrifugácii používajú rotory a záznamové systémy špeciálnej konštrukcie: umožňujú nepretržite monitorovať sedimentáciu materiálu.v odstredivé pole.

Analytické ultracentrifúgy môžu dosahovať rýchlosť až 70 000 otáčok za minútu -1 , pričom vytvára odstredivé zrýchlenie až 500 000g . Ich rotor má spravidla tvar elipsoidu a je pomocou struny spojený s motorom, čo umožňuje meniť rýchlosť otáčania rotora. Rotor sa otáča vo vákuovej komore vybavenej chladiacim zariadením a má dve bunky, analytickú a vyvažovaciu, ktoré sú inštalované v centrifúge striktne vertikálne, rovnobežne s osou otáčania. Vyvažovacia bunka slúži na vyváženie analytickej bunky a je to kovový blok s presným systémom. Má tiež dva indexové otvory umiestnené v presne definovanej vzdialenosti od osi otáčania, pomocou ktorých sa určujú zodpovedajúce vzdialenosti v analytickej bunke. Analytická bunka, zvyčajne 1 cm 3 , má sektorovú formu. Pri správnej inštalácii do rotora, napriek tomu, že je vzpriamený, funguje na rovnakom princípe ako rotor so zavesenými vedrami, čím vytvára takmer ideálne sedimentačné podmienky. Na koncoch analytickej cely sú okienka s kremennými sklami. Analytické ultracentrifúgy sú vybavené optickými systémami, ktoré umožňujú sledovať sedimentáciu častíc počas celej doby centrifugácie. Vo vopred stanovených časových intervaloch je možné sedimentujúci materiál fotografovať. Pri frakcionácii proteínov a DNA sa sedimentácia sleduje absorpciou v ultrafialovom žiarení a v prípadoch, keď majú študované roztoky rôzne indexy lomu, pomocou Schlierenovho systému alebo Rayleighovho interferenčného systému. Posledné dve metódy sú založené na skutočnosti, že pri prechode svetla cez priehľadný roztok pozostávajúci zo zón s rôznou hustotou sa svetlo láme na hranici zóny. Počas sedimentácie sa medzi zónami s ťažkými a ľahkými časticami vytvorí hranica, ktorá pôsobí ako refrakčná šošovka; v tomto prípade sa na fotografickej platni používanej ako detektor objaví vrchol. V priebehu sedimentácie sa pohybuje hranica a následne vrchol, ktorého rýchlosť pohybu možno použiť na posúdenie rýchlosti sedimentácie materiálu. Interferometrické systémy sú citlivejšie ako Schlierenove systémy. Analytické cely sú jednosektorové, ktoré sa používajú najčastejšie, a dvojsektorové, ktoré sa používajú na porovnávacie štúdium rozpúšťadla a rozpustenej látky.

V biológii sa analytická ultracentrifugácia používa na stanovenie molekulových hmotností makromolekúl, na kontrolu čistoty získaných vzoriek a na štúdium konformačných zmien makromolekúl.

2.8 Aplikácia analytickej ultracentrifugácie

2.8.1 Stanovenie molekulových hmotností

Existujú tri hlavné metódy na stanovenie molekulových hmotností pomocou analytickej ultracentrifugácie: stanovenie rýchlosti sedimentácie, metóda sedimentačnej rovnováhy a metóda aproximácie sedimentačnej rovnováhy.

Stanovenie molekulovej hmotnosti sedimentačnou rýchlosťou - toto je najbežnejšia metóda. Odstreďovanie sa vykonáva pri vysokých rýchlostiach, takže častice, spočiatku rovnomerne rozložené v celom objeme, sa začnú pohybovať v poradí pozdĺž polomeru od stredu otáčania. Medzi oblasťou rozpúšťadla, ktorá už neobsahuje častice, a tou jeho časťou, ktorá ich obsahuje, sa vytvorí jasné rozhranie. Táto hranica sa pohybuje počas odstreďovania, čo umožňuje určiť rýchlosť sedimentácie častíc pomocou jednej z vyššie uvedených metód, pričom sa tento pohyb zaznamená na fotografickej platni.

Rýchlosť sedimentácie je určená nasledujúcim vzťahom:

kdeX - vzdialenosť od osi otáčania v cm,

t - čas v s,

w- uhlová rýchlosť v rad-s -1 ,

s - sedimentačný koeficient „molekuly.

Sedimentačný koeficient je rýchlosť na jednotku zrýchlenia, meria sa vSeedbergove jednotky ; 1 swedberg jednotka sa rovná 10 _13 s. Číselná hodnotaszávisí od molekulovej hmotnosti a tvaru častíc a je to hodnota charakteristická pre danú molekulu alebo supramolekulárnu štruktúru. Sedimentačný koeficient lyzozýmu je napríklad 2,15S; katal aza má sedimentačný faktor 11,35S, podjednotky bakteriálnych ribozómov - od 30 do 50Sa podjednotky eukaryotických ribozómov - od 40 do 60S.

kdeM je molekulová hmotnosť molekuly,R je plyn konštantný,T je absolútna teplota,sje sedimentačný koeficient molekuly,D je difúzny koeficient molekuly,v - čiastočný špecifický objem, ktorý možno považovať za objem, ktorý zaberá jeden gram rozpustenej látky, p - hustota rozpúšťadla.

Metóda sedimentačnej bilancie. Stanovenie molekulových hmotností touto metódou sa vykonáva pri relatívne nízkych otáčkach rotora, rádovo 7 000 až 8 000 ot./min. -1 aby sa molekuly s veľkou molekulovou hmotnosťou neusadzovali na dne. Ultracentrifugácia sa vykonáva dovtedy, kým častice nedosiahnu rovnováhu, ktorá sa ustanoví pôsobením odstredivých síl na jednej strane a difúznych síl na strane druhej, to znamená, kým sa častice neprestanú pohybovať. Potom sa podľa výsledného koncentračného gradientu vypočíta molekulová hmotnosť látky podľa vzorca

kdeR je plyn konštantný,T - absolútna teplota, o - uhlová rýchlosť, p - hustota rozpúšťadla,v - čiastočný špecifický objem,s X as 2 je koncentrácia rozpustenej látky na vzdialenosťG G a g 2 od osi otáčania.

Nevýhodou tejto metódy je, že dosiahnutie sedimentačnej rovnováhy trvá dlho – od niekoľkých dní až po niekoľko týždňov pri nepretržitej prevádzke odstredivky.

Metóda približovania sa k sedimentačnej rovnováhe bola vyvinuté s cieľom zbaviť sa nevýhod predchádzajúcej metódy spojených s veľkou investíciou času potrebného na „vyrovnanie“. Pomocou tejto metódy je možné určiť molekulové hmotnosti, keď je odstredený roztok v stave priblíženia sa k rovnováhe. Po prvé, makromolekuly sú rovnomerne rozdelené po celom objeme analytickej bunky; potom, ako centrifugácia postupuje, molekuly sa usadia a hustota roztoku v oblasti menisku postupne klesá. Zmena hustoty sa starostlivo zaznamená a potom sa pomocou zložitých výpočtov s veľkým počtom premenných určí molekulová hmotnosť danej zlúčeniny podľa vzorcov:

kdeR je plyn konštantný,T je absolútna teplota,v - čiastočný špecifický objem, p - hustota rozpúšťadla,dcldr - gradient koncentrácie makromolekúl, g ma g d- vzdialenosť k menisku, resp. dnu tuby, s ma s d- koncentrácia makromolekúl v menisku a na dne skúmavky,M m aM R -hodnoty molekulových hmotností, určené distribúciou koncentrácie látky v menisku a na dne skúmavky.

2.8.2 Hodnotenie čistoty prípravkov

Analytická ultracentrifugácia sa široko používa na hodnotenie čistoty DNA, vírusov a proteínových prípravkov. Čistota prípravkov je nepochybne veľmi dôležitá v prípadoch, keď je potrebné presne určiť molekulovú hmotnosť molekuly. Vo väčšine prípadov možno homogenitu prípravku posúdiť podľa povahy sedimentačnej hranice, pričom sa použije metóda stanovenia rýchlosti sedimentácie: homogénny prípravok zvyčajne dáva jednu ostro definovanú hranicu. Nečistoty prítomné v prípravku sa javia ako ďalší vrchol alebo rameno; určujú aj asymetriu hlavného vrcholu.

2.8.3 Štúdium konformačných zmien v makromolekulách

Ďalšou oblasťou použitia analytickej ultracentrifugácie je štúdium konformačných zmien v makromolekulách. Molekula DNA môže byť napríklad jednovláknová alebo dvojvláknová, lineárna alebo kruhová. Pôsobením rôznych zlúčenín alebo pri zvýšených teplotách dochádza v DNA k množstvu reverzibilných a ireverzibilných konformačných zmien, ktoré možno určiť zmenou rýchlosti sedimentácie vzorky. Čím je molekula kompaktnejšia, tým je jej koeficient trenia v roztoku nižší a naopak: čím je menej kompaktná, tým je koeficient trenia väčší a tým pomalšie sedimentuje. Rozdiely v rýchlosti sedimentácie vzorky pred a po rôznych dopadoch na ňu teda umožňujú odhaliť konformačné zmeny vyskytujúce sa v makromolekulách.

V alosterických proteínoch, ako je napríklad aspartáttranskarbamoyláza, dochádza ku konformačným zmenám v dôsledku ich väzby na substrát a malé ligandy. Disociácia proteínu na podjednotky môže byť vyvolaná pôsobením látok, ako je močovina alebo parachlórortuťibenzoát. Všetky tieto zmeny možno ľahko monitorovať pomocou analytickej ultracentrifugácie.

Centrifugácia je separácia mechanických zmesí na ich zložky pôsobením odstredivej sily. Zariadenia používané na tento účel sa nazývajú centrifúgy. Hlavnou časťou odstredivky je rotor, v ktorom sú namontované hniezda pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča vysokou rýchlosťou, v dôsledku čoho vznikajú značné odstredivé sily, pôsobením ktorých sa oddeľujú mechanické zmesi, napríklad sa ukladajú častice suspendované v kvapaline.

Centrifúgy: 1 - ručné: 2 - s elektrickým pohonom.

V klinických a sanitárnych laboratóriách sa centrifugácia používa na oddelenie krvnej plazmy, od hustých častíc z tekutej časti moču a pod. Na tento účel sa používajú buď manuálne odstredivky (obr., 1) alebo elektrické odstredivky, rýchlosť otáčania ktorý je možné nastaviť (obr., 2).

Ultracentrifúgy, ktorých otáčky rotora presahujú 40 000 ot./min., sa v experimentálnej praxi zvyčajne používajú na separáciu bunkových organel, separáciu koloidných častíc, makromolekúl atď.

Centrifugácia je separácia hrubých systémov, pozostávajúcich z kvapalných a pevných zložiek s rôznou hustotou, pomocou špeciálnych prístrojov nazývaných odstredivky. Princíp činnosti odstredivky je založený na vytvorení veľkej odstredivej sily, pod vplyvom ktorej sa rýchlosť oddeľovania zložiek zmesi umiestnenej v odstredivke mnohonásobne zvyšuje v porovnaní s rýchlosťou ich oddeľovania pri pôsobení gravitácie.

Metóda odstreďovania je široko používaná v biológii, medicíne a technológii, často nahrádza procesy filtrovania, usadzovania a lisovania.

Odstredivka má kryt, pohonný mechanizmus, rotor, pracovnú (uzavieraciu) komoru a ovládací panel. Niektoré odstredivky sú vybavené elektrickými hodinami, ktoré zabezpečujú automatické vypnutie a brzdenie v rozsahu od 5 do 60 minút. Špeciálne centrifúgy majú chladiace a vákuové jednotky so sledovacím a automatickým riadiacim zariadením. Hlavnou časťou každej odstredivky je rotor (v laboratórnych odstredivkách býva umiestnený na zvisle uloženom hriadeli elektromotora alebo otáčaný rôznymi prevodmi z hriadeľa motora, niekedy aj ručne). Rotor odstredivky je disk (kríž) s kĺbovými objímkami pre kovové objímky, v ktorých sú umiestnené skúmavky, ktoré pri otáčaní zaujmú vodorovnú polohu.

Niekedy je rotor vyrobený vo forme pevného kovového zrezaného kužeľa s bunkami pre skúmavky (uhlový rotor); rúrky v ňom sú umiestnené v konštantnom uhle k osi otáčania (zvyčajne 40 °). Pri naklonenej polohe skúmaviek sa zložky zmesi oddeľujú rýchlejšie. Separácia zmesi sa uskutočňuje v skúmavkách rôznych tvarov a objemov (obr. 1). Pri práci pri vysokých rýchlostiach sa používajú skúmavky vyrobené z polyetylénu, pretože sklenené prasknú. Skúmavky so spracovávaným materiálom umiestnené jedna proti druhej v rotore musia byť vyvážené. To poskytuje rovnomerné zaťaženie hriadeľa rotora a zabezpečuje rovnomerné otáčanie hriadeľa odstredivky. Na vyváženie skúmaviek sa používajú špeciálne váhy (obr. 2).

Ryža. 1. Skúmavky na odstreďovanie.

Ryža. 2. Odstredivé váhy.

Centrifúgy používané v priemysle sa líšia od laboratórnych centrifúg zložitejšou konštrukciou rotora, ktorá umožňuje súčasne odstreďovať veľké množstvo materiálu alebo vykonávať kontinuálne separačné procesy.

Centrifúgy s nízkou rýchlosťou rotora sa používajú v medicíne na separáciu močových sedimentov, krvného séra od zrazenín, sedimentáciu erytrocytov, v sérologických štúdiách atď.

Mikrocentrifúga (obr. 4) je ovládaná ručne; vybavená dvoma vymeniteľnými dýzami, z ktorých jedna má hniezda pre mikroskúmavky a používa sa na stanovenie kompatibility krvi; druhý - s hrdlom na vloženie odmernej mikropipety (hematokrit) - je určený na stanovenie percenta krviniek.

Ryža. 3. Ručná odstredivka.

Ryža. 4. Mikrocentrifúga.

Manuálna odstredivka (obr. 3) má štyri kovové alebo plastové návleky na 15 ml skúmavky.

Laboratórna klinická centrifúga TsLK-1 (obr. 5, 7) má tri rýchlosti otáčania (1000, 1500, 3000 ot./min.). Krížový rotor je prispôsobený pre 12 bežných odstredivkových skúmaviek. Najväčší objem odstredenej kvapaliny je 150 ml.

Centrifúgy s vysokou rýchlosťou rotora sú vo väčšine prípadov vybavené výmennými rotormi určenými pre rôzne objemy kvapaliny a slúžia na separáciu jemných suspenzií.

Laboratórna stolná centrifúga TsLN-2 (obr. 5, 2) má uhlový rotor pre šesť krátkych skúmaviek s celkovou kapacitou 72 ml. Maximálna rýchlosť otáčania -9000 ot./min.

Ryža. 5. Rôzne laboratórne centrifúgy: 1 - klinické; 2 - pracovná plocha; 3 - roh malý; 4 - stacionárne; 5 - chladnička.

Malouhlová odstredivka TsUM-1 (obr. 5, 3) má tri vymeniteľné uhlové rotory s rôznym počtom skúmaviek a hematokritom: rotor na 6 skúmaviek s celkovou kapacitou 150 ml, rotor na 10 skúmaviek s celkovým objem 120 ml, rotor pre 24 skúmaviek s celkovou kapacitou 120 ml, hematokrit pre dve kapiláry. Maximálna rýchlosť otáčania je 10 000 ot./min.

Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom.

Laboratórna stacionárna odstredivka TsLS-2 (obr. 5, 4) má dva vymeniteľné rotory. Krížový rotor je vybavený štyrmi oceľovými objímkami s objemom 500 ml a štyrmi sklenenými skúmavkami k nim s objemom 250 ml. Uhlový rotor je dodávaný s 8 polyetylénovými a oceľovými skúmavkami s objemom 50-75 ml. Maximálne otáčky rotorov sú až 6000 ot./min. Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom.

Medzi špeciálne centrifúgy patrí laboratórna chladená centrifúga CLR-1 (obr. 5.5), určená na odstreďovanie pri nízkych teplotách (-5 ° a viac) rôznych látok, ktoré sa menia aj pri izbovej teplote – väčšinou sú to proteínové suspenzie. Odstredivka má tri vymeniteľné rotory poskytujúce rôzne režimy odstreďovania. Dva rotory sa technickými vlastnosťami zhodujú s rotormi odstredivky typu TsLS-2, tretí rotor, ktorý je umiestnený na prídavnej náprave, vyvinie 18 000-18 500 ot./min. Maximálny objem skúšaného lieku je 48 ml. Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom. Chladenie pracovnej komory sa vykonáva pomocou chladiaceho stroja.

Pozri tiež Ultracentrifugácia.

Práca na kurze

odstreďovanie

1. Princíp metódy

V odstredivom poli sa častice s rôznymi hustotami, tvarmi alebo veľkosťami ukladajú rôznymi rýchlosťami. Rýchlosť sedimentácie závisí od odstredivého zrýchlenia, ktoré je priamo úmerné uhlovej rýchlosti rotora a vzdialenosti medzi časticou a osou rotácie:

a odstredivé zrýchlenie potom bude

Keďže jedna otáčka rotora je 2 n radiánov, uhlovú rýchlosť rotora v otáčkach za minútu možno zapísať ako:

Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkách g a nazýva sa relatívne odstredivé zrýchlenie, t.j.

Pri uvádzaní podmienok oddeľovania častíc uveďte rýchlosť otáčania a polomer rotora, ako aj čas odstreďovania. Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkách g, vypočítané z priemerného polomeru otáčania stĺpca kvapaliny v centrifugačnej skúmavke. Dole a Kotzias na základe rovnice zostavili nomogram vyjadrujúci závislosť GCF od rýchlosti rotora a polomeru r.

kde t je čas sedimentácie v sekundách, rj je viskozita média, rh je polomer častice, rf je hustota častice, p je hustota média, hm je vzdialenosť od osi rotácie k menisku kvapaliny, kde je vzdialenosť od osi rotácie k dnu skúmavky.

Preparatívna centrifugácia spočíva v izolácii biologického materiálu pre následné biochemické štúdie. V tomto prípade sa môžu odobrať veľké množstvá počiatočného biologického materiálu, napríklad inokulácie mikrobiálnych buniek zo vsádzkových alebo kontinuálnych kultúr, ako aj inokulácie rastlinných a živočíšnych buniek z kultúr tkanív a krvnej plazmy. Pomocou preparatívnej centrifugácie sa izoluje veľké množstvo bunkových častíc na štúdium ich morfológie, štruktúry a biologickej aktivity. Spôsob sa tiež používa na izoláciu takých biologických makromolekúl, ako je DNA a proteíny, z predtým purifikovaných prípravkov.

Analytická centrifugácia sa používa hlavne na štúdium čistých alebo v podstate čistých prípravkov makromolekúl alebo častíc, ako sú ribozómy. V tomto prípade sa používa malé množstvo materiálu a sedimentácia študovaných častíc sa nepretržite zaznamenáva pomocou špeciálnych optických systémov. Metóda umožňuje získať údaje o čistote, molekulovej hmotnosti a štruktúre materiálu. V pregraduálnych workshopoch sa preparatívna centrifugácia používa oveľa častejšie ako analytická, preto sa jej budeme venovať podrobnejšie, hoci obe metódy sú založené na spoločných princípoch.

2. Preparatívna centrifugácia

2.1 Diferenciálna centrifugácia

2.2 Rýchlostná zónová centrifugácia

Metóda zonálnej rýchlosti, alebo, ako sa tiež nazýva, s-zonálna centrifugácia, spočíva vo vrstvení testovanej vzorky na povrchu roztoku s kontinuálnym gradientom hustoty. Vzorka sa potom odstreďuje, kým sa častice nerozdelia pozdĺž gradientu v diskrétnych zónach alebo pásoch. Vytvorením gradientu hustoty je možné vyhnúť sa zmiešaniu zón, ktoré sú výsledkom konvekcie. Metóda rýchlostnej zónovej centrifugácie sa používa na oddelenie hybridov RNA-DNA, podjednotiek ribozómov a iných bunkových zložiek.

2.3 Izopyknické odstreďovanie

Ďalším spôsobom je vrstvenie vzorky na povrch roztoku s kontinuálnym hustotným gradientom pokrývajúcim rozsah hustôt všetkých zložiek zmesi. Odstreďovanie sa vykonáva dovtedy, kým sa hustota častíc nerovná hustote zodpovedajúcich zón, t.j. kým sa častice nerozdelia do zón. Metóda sa nazýva zonálna izopyknická alebo rezonančná centrifugácia, pretože hlavným bodom je tu vztlaková hustota a nie veľkosť alebo tvar častíc. Množstvo hustoty, pri ktorej častice tvoria izopyknálne pásy, je ovplyvnené povahou suspenzného média; častice môžu byť priepustné pre niektoré zlúčeniny v roztoku a nepriepustné pre iné, alebo môžu pripájať molekuly roztoku. Pri použití zonálneho rotora sa mitochondrie, lyzozómy, peroxizómy a mikrozómy koncentrujú v pásoch so 42 %, 47 %, 47 % a 27 % sacharózy, čo zodpovedá hustote 1,18, 1,21, 1,21 a 1,10 g-cm-3. Hustota subcelulárnych organel závisí aj od ich selektívneho príjmu určitých zlúčenín. Zavedenie detergentu Triton WR-1339 potkanom, ktorý nespôsobuje hemolýzu, vedie k zvýšeniu veľkosti a zníženiu hustoty pečeňových lyzozómov; hustota mitochondrií a peroxizómov zostáva nezmenená. Napriek tomu, že sedimentačné vlastnosti lyzozómov sa spravidla nemenia, ich rovnovážna hustota v gradiente sacharózy klesá z 1,21 na 1,1, čo vedie k zodpovedajúcej separácii lyzozomálno-peroxizomálnej frakcie. Táto vlastnosť sa využíva pri kvantitatívnej separácii lyzozómov, mitochondrií a peroxizómov na základe odstránenia všetkých častíc s hustotou väčšou ako je hustota mikrozómov z homogénneho média a následnej izopyknálnej centrifugácie vyzrážaných ťažkých častíc.

2.4 Odstreďovanie s gradientom rovnovážnej hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa používajú soli ťažkých kovov, ako je rubídium alebo cézium, ako aj roztoky sacharózy. Vzorka, ako je DNA, sa zmieša s koncentrovaným roztokom chloridu cézneho. Rozpustená látka aj rozpúšťadlo sú na začiatku rovnomerne distribuované v celom objeme. Počas odstreďovania sa nastaví rovnovážna distribúcia koncentrácie a následne aj hustota CsCl, pretože cézne ióny majú veľkú hmotnosť. Pôsobením odstredivého zrýchlenia sa molekuly DNA redistribuujú a zhromažďujú sa vo forme oddelenej zóny v časti skúmavky s hustotou zodpovedajúcou im. Metóda sa používa hlavne pri analytickej centrifugácii a použili ju Meselson a Stahl na štúdium mechanizmu replikácie DNA E. coli. Odstreďovanie s rovnovážnym hustotným gradientom je tiež jednou z metód separácie a štúdia lipoproteínov ľudskej plazmy.

2.5 Tvarovanie a extrakcia gradientov

2.5.1 Povaha gradientov

Na vytvorenie hustotných gradientov roztokov sa najčastejšie používajú roztoky sacharózy, niekedy s pevným pH. V niektorých prípadoch sa dobré oddelenie dosiahne použitím D20 namiesto obyčajnej vody. 2.1 sú uvedené vlastnosti niektorých roztokov sacharózy.

Voľba gradientu je daná špecifickými úlohami frakcionácie. Napríklad fikol vyrábaný spoločnosťou Pharmacia FineChemicals môže nahradiť sacharózu v prípadoch, keď je potrebné vytvoriť gradienty s vysokou hustotou a nízkym osmotickým tlakom. Ďalšou výhodou ficol je, že neprechádza cez bunkové membrány. Soli ťažkých kovov, ako je rubídium a cézium, sa používajú na vytváranie gradientov vyššej hustoty, avšak v dôsledku korozívneho účinku CsCl sa takéto gradienty používajú iba v rotoroch vyrobených z odolných kovov, ako je titán.

2.5.2 Technika stupňovitého gradientu hustoty

2.5.3 Technika vytvárania hladkého gradientu hustoty

2.5.4 Extrakcia gradientov z centrifugačných skúmaviek

2.5.5 Preparatívne centrifúgy a ich použitie

Preparatívne centrifúgy možno rozdeliť do troch hlavných skupín: centrifúgy na všeobecné použitie, vysokorýchlostné centrifúgy a preparatívne ultracentrifúgy. Odstredivky na všeobecné použitie poskytujú maximálnu rýchlosť 6000 otáčok za minútu a RCF až 6000 g. Líšia sa od seba iba kapacitou a majú množstvo vymeniteľných rotorov: hranaté a so závesnými okuliarmi. Jednou z vlastností tohto typu centrifúg je ich veľká kapacita - od 4 do 6 dm3, čo umožňuje ich nakladanie nielen centrifugačnými skúmavkami 10,50 a 100 cm3, ale aj nádobami s objemom až 1,25 dm3. Vo všetkých centrifúgach tohto typu sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli a rúrky centrifúgy spolu s ich obsahom musia byť starostlivo vyvážené a musia sa líšiť v hmotnosti nie viac ako 0,25 g, mali by byť umiestnené symetricky, jedna proti sebe. iné, čím sa zabezpečí rovnomerné rozloženie skúmaviek vzhľadom na os otáčania rotora.

Vysokorýchlostné odstredivky poskytujú maximálnu rýchlosť 25 000 ot./min. a RCF až 89 000 g. Komora rotora je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje zahrievaniu, ku ktorému dochádza v dôsledku trenia počas otáčania rotora. Rýchlobežné odstredivky majú spravidla objem 1,5 dm3 a sú vybavené vymeniteľnými rotormi, ako uhlovými, tak aj závesnými vedrami.

Preparatívne ultracentrifúgy poskytujú maximálnu rýchlosť až 75 000 otáčok za minútu a maximálne odstredivé zrýchlenie 510 000 g. Sú vybavené chladničkou aj vákuovou jednotkou, aby nedochádzalo k prehrievaniu rotora v dôsledku jeho trenia o vzduch. Rotory takýchto centrifúg sú vyrobené z vysokopevnostného hliníka alebo zliatin titánu. Používajú sa hlavne rotory z hliníkovej zliatiny, avšak v prípadoch, kde sa vyžadujú obzvlášť vysoké otáčky, sa používajú rotory z titánu. Na zníženie vibrácií spôsobených nevyváženosťou rotora v dôsledku nerovnomerného plnenia centrifugačných skúmaviek majú ultracentrifúgy ohybný hriadeľ. Skúmavky centrifúgy a ich obsah musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na 0,1 g. Podobné požiadavky by sa mali dodržiavať aj pri plnení rotorov centrifúg na všeobecné použitie.

2.6 Konštrukcia rotorov

2.6.1 Uhlové rotory a rotory so závesnými vedrami

2.6.2 Priebežné rotory

Kontinuálne rotory sú určené na vysokorýchlostnú frakcionáciu relatívne malých množstiev pevného materiálu z veľkoobjemových suspenzií, napríklad na izoláciu buniek z kultivačných médií. Počas odstreďovania sa do rotora kontinuálne pridáva suspenzia častíc; Priepustnosť rotora závisí od charakteru ukladaného prípravku a pohybuje sa od 100 cm3 do 1 dm3 za minútu. Zvláštnosťou rotora je, že ide o izolovanú komoru špeciálnej konštrukcie; jeho obsah nekomunikuje s vonkajším prostredím, a preto nie je znečistený ani postriekaný.

2.6.3 Zonálne alebo Andersonove rotory

Plnenie rotora sa vykonáva pri jeho otáčaní rýchlosťou asi 3000 ot./min. Do rotora sa čerpá vopred vytvorený gradient, počnúc vrstvou s najnižšou hustotou, ktorá je rovnomerne rozložená po obvode rotora a je držaná na jeho vonkajšej stene kolmej na os otáčania v dôsledku odstredivej sily. S následným pridávaním vrstiev s vyšším hustotným gradientom nastáva kontinuálny posun smerom k stredu menej hustých vrstiev. Po načerpaní celého gradientu do rotora sa rotor naplní do svojho plného objemu roztokom nazývaným „vankúš“, ktorého hustota je rovnaká alebo mierne presahuje najvyššiu hustotu vopred vytvoreného gradientu.

Potom sa cez axiálnu trubicu navrství skúšobná vzorka, ktorá sa pomocou roztoku s nižšou hustotou vytlačí z trubice do objemu rotora, pričom sa z obvodu odstráni rovnaký objem "vankúšika". Po všetkých týchto postupoch sa rýchlosť otáčania rotora prispôsobí prevádzkovej rýchlosti a počas požadovaného časového obdobia sa vykonáva buď zonálna rýchlosť alebo zonálna izopyknická frakcionácia. Extrakcia frakcií sa uskutočňuje pri rýchlosti rotora 3000 ot/min - min-1. Obsah rotora sa premiestňuje pridaním „vankúše“ z periférie, najskôr sa premiestnia menej husté vrstvy. Vďaka špeciálnej konštrukcii axiálneho kanála Andersonovho rotora nedochádza k miešaniu zón pri ich premiestňovaní. Odchádzajúci gradient prechádza cez záznamové zariadenie, napríklad spektrofotometrickú celu, pomocou ktorej je možné stanoviť obsah proteínu absorpciou pri 280 nm, alebo cez špeciálny detektor rádioaktivity, po ktorom sa zbierajú frakcie.

Kapacita zonálnych rotorov používaných pri stredných rýchlostiach sa pohybuje od 650 do 1600 cm3, čo umožňuje získať pomerne veľké množstvo materiálu. Zonálne rotory sa používajú na odstránenie proteínových kontaminantov z rôznych prípravkov a na izoláciu a čistenie mitochondrií, lyzozómov, polyzómov a proteínov.

2.6.4 Analýza subcelulárnych frakcií

Analýza distribúcie enzýmov vo frakcionovaných tkanivách je založená na dvoch všeobecných princípoch. Prvým z nich je, že všetky častice danej subcelulárnej populácie obsahujú rovnakú sadu enzýmov. Druhý predpokladá, že každý enzým je lokalizovaný na nejakom špecifickom mieste v bunke. Ak by bola táto poloha pravdivá, potom by enzýmy mohli pôsobiť ako markery pre zodpovedajúce organely: napríklad cytochrómoxidáza a monoaminooxidáza by slúžili ako mitochondriálne markerové enzýmy, kyslé hydrolázy ako lyzozómové markery, kataláza ako peroxizómový marker a glukóza-6- fosfatáza - marker mikrozomálnej membrány. Ukázalo sa však, že niektoré enzýmy, napríklad malátdehydrogenáza, P-glukuronidáza, NADP-H-cytochróm-c-reduktáza, sú lokalizované vo viac ako jednej frakcii, preto výber enzýmových markerov subcelulárnych frakcií v každej špecifickej k prípadu by sa malo pristupovať veľmi opatrne. Navyše neprítomnosť markerového enzýmu neznamená absenciu zodpovedajúcich organel. Je pravdepodobné, že počas frakcionácie sa enzým organelami stratí alebo je inhibovaný či inaktivovaný, takže aspoň dva markerové enzýmy sa zvyčajne stanovujú pre každú frakciu.

Zlomok	Objem, cm"	Všeobecný chov	Exnulácia, 660 nm	Jednotky aktivity enzýmov	Výťažok aktivity v zlomkoch, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Frakcionácia diferenciálnym odstreďovaním

2.7.1 Prezentácia výsledkov

2.7.2 Analytická ultracentrifugácia

Na rozdiel od preparatívnej centrifugácie, ktorej účelom je separovať látky a čistiť ich, analytická ultracentrifugácia sa používa najmä na štúdium sedimentačných vlastností biologických makromolekúl a iných štruktúr. Preto sa pri analytickom odstreďovaní používajú rotory a záznamové systémy špeciálnej konštrukcie: umožňujú nepretržite monitorovať sedimentáciu materiálu v odstredivom poli.

Analytické ultracentrifúgy môžu dosiahnuť rýchlosť až 70 000 otáčok za minútu, pričom generujú odstredivé zrýchlenie až 500 000 g. Ich rotor má spravidla tvar elipsoidu a je pomocou struny spojený s motorom, čo umožňuje meniť rýchlosť otáčania rotora. Rotor sa otáča vo vákuovej komore vybavenej chladiacim zariadením a má dve bunky, analytickú a vyvažovaciu, ktoré sú inštalované v centrifúge striktne vertikálne, rovnobežne s osou otáčania. Vyvažovacia bunka slúži na vyváženie analytickej bunky a je to kovový blok s presným systémom. Má tiež dva indexové otvory umiestnené v presne definovanej vzdialenosti od osi otáčania, pomocou ktorých sa určujú zodpovedajúce vzdialenosti v analytickej bunke. Analytická bunka, ktorej kapacita je zvyčajne 1 cm3, má sektorový tvar. Pri správnej inštalácii do rotora, napriek tomu, že je vzpriamený, funguje na rovnakom princípe ako rotor so zavesenými vedrami, čím vytvára takmer ideálne sedimentačné podmienky. Na koncoch analytickej cely sú okienka s kremennými sklami. Analytické ultracentrifúgy sú vybavené optickými systémami, ktoré umožňujú sledovať sedimentáciu častíc počas celej doby centrifugácie. Vo vopred stanovených časových intervaloch je možné sedimentujúci materiál fotografovať. Pri frakcionácii proteínov a DNA sa sedimentácia sleduje absorpciou v ultrafialovom žiarení a v prípadoch, keď majú študované roztoky rôzne indexy lomu, pomocou Schlierenovho systému alebo Rayleighovho interferenčného systému. Posledné dve metódy sú založené na skutočnosti, že pri prechode svetla cez priehľadný roztok pozostávajúci zo zón s rôznou hustotou sa svetlo láme na hranici zóny. Počas sedimentácie sa medzi zónami s ťažkými a ľahkými časticami vytvorí hranica, ktorá pôsobí ako refrakčná šošovka; v tomto prípade sa na fotografickej platni používanej ako detektor objaví vrchol. V priebehu sedimentácie sa pohybuje hranica a následne vrchol, ktorého rýchlosť pohybu možno použiť na posúdenie rýchlosti sedimentácie materiálu. Interferometrické systémy sú citlivejšie ako Schlierenove systémy. Analytické cely sú jednosektorové, ktoré sa používajú najčastejšie, a dvojsektorové, ktoré sa používajú na porovnávacie štúdium rozpúšťadla a rozpustenej látky.

2.8 Aplikácia analytickej ultracentrifugácie

2.8.1 Stanovenie molekulových hmotností

Najbežnejšou metódou je stanovenie molekulovej hmotnosti sedimentačnou rýchlosťou. Odstreďovanie sa vykonáva pri vysokých rýchlostiach, takže častice, spočiatku rovnomerne rozložené v celom objeme, sa začnú pohybovať v poradí pozdĺž polomeru od stredu otáčania. Medzi oblasťou rozpúšťadla, ktorá už neobsahuje častice, a tou jeho časťou, ktorá ich obsahuje, sa vytvorí jasné rozhranie. Táto hranica sa pohybuje počas odstreďovania, čo umožňuje určiť rýchlosť sedimentácie častíc pomocou jednej z vyššie uvedených metód, pričom sa tento pohyb zaznamená na fotografickej platni.

Rýchlosť sedimentácie je určená nasledujúcim vzťahom:

kde x je vzdialenosť od osi rotácie v cm,

t - čas v s,

w je uhlová rýchlosť v rad-s-1,

s je sedimentačný koeficient „molekuly.

Sedimentačný koeficient je rýchlosť na jednotku zrýchlenia a meria sa v Seedbergových jednotkách; 1 Swedbergova jednotka sa rovná 10_13 s. Číselná hodnota s závisí od molekulovej hmotnosti a tvaru častíc a je to hodnota charakteristická pre danú molekulu alebo supramolekulárnu štruktúru. Sedimentačný koeficient lyzozýmu je napríklad 2,15 S; kataláza má sedimentačný koeficient 11,35S, bakteriálne ribozómové podjednotky od 30 do 50S a eukaryotické ribozómové podjednotky od 40 do 60S.

kde M je molekulová hmotnosť molekuly, R je plynová konštanta, T je absolútna teplota, s je sedimentačný koeficient molekuly, D je difúzny koeficient molekuly, v je čiastočný špecifický objem, ktorý môže byť považovaný za objem, ktorý zaberá jeden gram rozpustenej látky, p je hustota rozpúšťadla.

Metóda sedimentačnej bilancie. Stanovenie molekulových hmotností touto metódou sa uskutočňuje pri relatívne nízkych otáčkach rotora, rádovo 7 000 až 8 000 ot./min., aby sa molekuly s veľkou molekulovou hmotnosťou neusadzovali na dne. Ultracentrifugácia sa vykonáva dovtedy, kým častice nedosiahnu rovnováhu, ktorá sa ustanoví pôsobením odstredivých síl na jednej strane a difúznych síl na strane druhej, to znamená, kým sa častice neprestanú pohybovať. Potom sa podľa výsledného koncentračného gradientu vypočíta molekulová hmotnosť látky „podľa vzorca

kde R je konštanta plynu, T je absolútna teplota, ω je uhlová rýchlosť, p je hustota rozpúšťadla, v je čiastočný špecifický objem, cx a c2 sú koncentrácia rozpustenej látky vo vzdialenostiach r a r2 od os otáčania.

Nevýhodou tejto metódy je, že dosiahnutie sedimentačnej rovnováhy trvá dlho – od niekoľkých dní až po niekoľko týždňov pri nepretržitej prevádzke odstredivky.

Metóda približovania sa k sedimentačnej rovnováhe bola vyvinutá s cieľom zbaviť sa nevýhod predchádzajúcej metódy spojenej s veľkou investíciou času potrebného na "ustanovenie rovnováhy. Pomocou tejto metódy možno určiť molekulové hmotnosti, keď je odstredený roztok v stav priblíženia k rovnováhe. Najprv sa makromolekuly rovnomerne rozložia po celom objeme analytickej kyvety, potom sa pri postupujúcej centrifugácii molekuly usadzujú a hustota roztoku v oblasti menisku sa postupne znižuje. starostlivo zaznamenané a potom zložitými výpočtami zahŕňajúcimi veľký počet premenných sa molekulová hmotnosť danej zlúčeniny určí podľa vzorcov:

kde R je konštanta plynu, T je absolútna teplota, v je čiastočný špecifický objem, p je hustota rozpúšťadla, dcldr je koncentračný gradient makromolekuly, gm a gd sú vzdialenosť k menisku a dnu v skúmavke, cm a sd sú koncentrácie makromolekúl na menisku a y na dne skúmavky, v tomto poradí, Mm a MR sú hodnoty molekulových hmotností, určené z distribúcie koncentrácie látky pri meniskus a dno trubice.

2.8.2 Hodnotenie čistoty prípravkov

2.8.3 Štúdium konformačných zmien v makromolekulách