Czym jest wirowanie w chemii. wirowanie

Prezentacja Opis Wirowanie. Jego zastosowanie w różnych dziedzinach biologii. przez slajdy

Wirowanie. Jego zastosowanie w różnych dziedzinach biologii. Wypełnił: Levikov, D.A.

Wirowanie Jest to rozdzielanie mieszanin mechanicznych na ich części składowe poprzez działanie siły odśrodkowej. Urządzenia używane do tego celu nazywane są wirówkami. Główną częścią wirówki jest wirnik z zamontowanymi w nim gniazdami na probówki wirówkowe. Wirnik obraca się z dużą prędkością, w wyniku czego powstają znaczne siły odśrodkowe, pod wpływem których oddzielane są mieszaniny mechaniczne, na przykład osadzają się cząstki zawieszone w cieczy.

Procesy zachodzące w wirówce W wirówkach dzielone są następujące procesy: 1) Filtracja wirówkowa. 2) Osadzanie odśrodkowe. 3) klarowanie odśrodkowe.

Filtracja odśrodkowa Filtracja odśrodkowa to proces oddzielania zawiesin w wirówkach z perforowaną misą. Wewnętrzna powierzchnia takiego bębna pokryta jest tkaniną filtracyjną. Zawiesina jest wyrzucana siłą odśrodkową na ścianki bębna, podczas gdy faza stała pozostaje na powierzchni tkaniny, a ciecz przepływa przez warstwę osadu pod działaniem siły odśrodkowej i tkanina jest usuwana na zewnątrz przez otwory w perkusja. Filtracja odśrodkowa składa się zwykle z trzech następujących po sobie procesów fizycznych: 1) filtracji z tworzeniem osadu; 2) zagęszczanie osadów; 3) usuwanie z osadu cieczy utrzymywanej przez siły molekularne;

Osadzanie odśrodkowe Osadzanie odśrodkowe to proces oddzielania zawiesin w wirówkach z bębnami o litych ściankach. Zawiesina jest wprowadzana do dolnej części bębna i wyrzucana na ściany pod działaniem siły odśrodkowej. Na ściankach tworzy się warstwa osadu, a ciecz tworzy warstwę wewnętrzną i jest wypierana z bębna przez zawiesinę wchodzącą do separacji. Jednocześnie ciecz unosi się do góry, przelewa się przez obrzeże bębna i jest usuwana na zewnątrz. W tym przypadku zachodzą dwa procesy fizyczne: 1) Osadzanie fazy stałej. 2) Zagęszczanie osadów.

Klarowanie odśrodkowe Klarowanie odśrodkowe to proces oddzielania drobnych zawiesin i roztworów koloidalnych. Przeprowadza się go również w solidnych bębnach. W sensie fizycznym klarowanie odśrodkowe to proces swobodnego osiadania cząstek stałych w polu sił odśrodkowych. W beczkach o litych ściankach przeprowadza się również separację emulsji. Pod działaniem siły odśrodkowej składniki emulsji, zgodnie z gęstością, układają się w postaci oddzielonych warstw: zewnętrznej warstwy cieczy o większej gęstości i wewnętrznej warstwy cieczy lżejszej. Ciecze są odprowadzane z bębna oddzielnie.

W laboratoriach kliniczno-sanitarnych wirowanie służy do oddzielania erytrocytów od osocza krwi, skrzepów krwi od surowicy, cząstek stałych z płynnej części moczu itp. W tym celu stosuje się wirówki ręczne lub wirówki elektryczne, których prędkość obrotowa Może być dopasowane. Ultrawirówki, których prędkość wirnika przekracza 40 000 obr./min, są zwykle stosowane w praktyce doświadczalnej do oddzielania organelli komórkowych, oddzielania cząstek koloidalnych, makrocząsteczek i polimerów.

Metoda wirowania w cytologii Metoda wirowania różnicowego służy do frakcjonowania komórek, czyli rozdzielania ich zawartości na frakcje w zależności od ciężaru właściwego różnych organelli i wtrąceń komórkowych. Aby to zrobić, drobno zmielone komórki są obracane w specjalnym aparacie - ultrawirówce. W wyniku odwirowania składniki komórkowe wytrącają się z roztworu, układając się zgodnie ze swoją gęstością. Gęste struktury osadzają się przy niższych prędkościach wirowania, podczas gdy mniej gęste struktury osadzają się przy dużych prędkościach wirowania. Powstałe warstwy rozdziela się i bada oddzielnie.

Wirowanie w botanice i fizjologii roślin Wirowanie umożliwia otrzymanie różnych frakcji cząstek subkomórkowych oraz badanie właściwości i funkcji każdej frakcji z osobna. Na przykład chloroplasty można wyizolować z liści szpinaku, wypłukać z fragmentów komórek przez wielokrotne wirowanie w odpowiedniej pożywce i zbadać ich zachowanie w różnych warunkach doświadczalnych lub określić ich skład chemiczny. Ponadto, stosując różne modyfikacje techniki, możliwe jest zniszczenie tych plastydów i wyizolowanie ich elementów składowych za pomocą wirowania różnicowego (powtarzana sedymentacja cząstek przy różnych wartościach przyspieszenia). W ten sposób udało się wykazać, że plastydy zawierają struktury, które wyróżnia bardzo uporządkowana struktura – tzw. grana; wszystkie grana znajdują się w błonie ograniczającej chloroplast (otoczka chloroplastowa). Zalety tej metody są po prostu nie do przecenienia, ponieważ pozwala ujawnić istnienie funkcjonalnych podjednostek, które są częścią większych cząstek subkomórkowych; w szczególności metodą wirowania różnicowego można było wykazać, że grana jest głównym elementem strukturalnym chloroplastu.

Metoda wirowania w wirusologii Metoda wirowania w gradiencie gęstości Bracke'a może być stosowana zarówno do izolacji, jak i ilościowego oznaczania wirusów roślinnych. Jak się okazało, metoda ta jest obarczona wieloma możliwościami i jest obecnie szeroko stosowana w dziedzinie wirusologii i biologii molekularnej. Podczas prowadzenia badań przez wirowanie w gradiencie gęstości probówka wirówkowa jest częściowo wypełniona roztworem, którego gęstość maleje w kierunku od dołu do menisku. Sacharoza jest najczęściej używana do tworzenia gradientu we frakcjonowaniu wirusów roślinnych. Przed rozpoczęciem wirowania cząstki wirusa można rozprowadzić w roztworze lub nanieść na szczyt gradientu. Brakke zaproponował trzy różne techniki wirowania w gradiencie gęstości. W wirowaniu izotopowym (równowagowym) proces trwa do momentu, gdy wszystkie cząstki w gradiencie osiągną poziom, przy którym gęstość ośrodka jest równa ich gęstości. Zatem frakcjonowanie cząstek następuje w tym przypadku zgodnie z różnicami w ich gęstości. Roztwory sacharozy nie mają wystarczającej gęstości do izopikalnego rozdzielenia wielu wirusów. W szybkim wirowaniu strefowym wirus jest najpierw nakładany na wcześniej utworzony gradient. Cząsteczki każdego rodzaju osadzają się, tworząc gradient w postaci strefy lub pasma, w tempie zależnym od ich wielkości, kształtu i gęstości. Wirowanie jest następnie przerywane, gdy cząstki nadal sedymentują. Równowagowe wirowanie strefowe jest podobne do wirowania strefowego z dużą prędkością, ale w tym przypadku wirowanie jest kontynuowane aż do osiągnięcia stanu izopikalnego. Rolą gradientu gęstości w wirowaniu z dużą prędkością jest zapobieganie konwekcji i utrwalanie różnych typów cząsteczek w określonych strefach. Teoria stojąca za wirowaniem w gradiencie gęstości jest złożona i niezbyt dobrze poznana. W praktyce jest to prosta i elegancka metoda, która jest szeroko stosowana podczas pracy z wirusami roślin.

Trudności w stosowaniu metody wirowania Stosowanie metody wirowania różnicowego wiąże się z wieloma trudnościami metodologicznymi. Po pierwsze, gdy cząsteczki zostaną wyizolowane, ich struktura może zostać uszkodzona. Dlatego konieczne było opracowanie specjalnych metod niszczenia komórek, które nie powodowałyby uszkodzenia struktury frakcji subkomórkowych. Po drugie, ponieważ cząstki subkomórkowe mają błony, podczas ich uwalniania mogą wystąpić różne efekty osmotyczne. W konsekwencji, aby ultrastruktura badanych obiektów nie uległa zniszczeniu nawet podczas ich izolacji, konieczne jest staranne dobranie składu pożywki, w której komórki są niszczone, a cząstki wytrącane. I wreszcie, płukanie cząstek subkomórkowych (ich ponowne zawieszenie w pożywce, a następnie odwirowanie) może prowadzić do utraty niektórych zawartych w nich substancji, które pod wpływem sił dyfuzyjnych przechodzą do roztworu. W związku z tym czasami trudno jest zrozumieć, które z małych cząsteczek są tak naprawdę elementami badanych struktur, a które zostały po prostu zaadsorbowane przez ich powierzchnię w procesie izolacji. Sytuacja ta utrudnia dokładne określenie niektórych właściwości użytkowych wybranych obiektów.

Wirowanie Jest to rozdział mieszanin mechanicznych na ich części składowe.
przez działanie siły odśrodkowej. Instrumenty używane do tego
cele nazywane są wirówkami.
Główną częścią wirówki jest wirnik z zamontowanym w
gniazduje na probówki wirówkowe. Wirnik obraca się z
duża prędkość, co skutkuje znacznym
wielkość siły odśrodkowej, pod wpływem której
mieszanki mechaniczne są rozdzielane, na przykład
sedymentacja cząstek zawieszonych w cieczy.

Procesy zachodzące w wirówce

Wirówki dzielą następujące procesy:
1) Filtracja odśrodkowa.
2) Osadzanie odśrodkowe.
3) klarowanie odśrodkowe.

filtracja odśrodkowa

Filtracja odśrodkowa jest
proces rozdzielania zawiesin w wirówkach z
perforowane bębny. Powierzchnia wewnętrzna
takiego bębna pokryta jest tkaniną filtracyjną.
Zawiesina jest wyrzucana przez siłę odśrodkową w kierunku
ścianki bębna, podczas gdy faza stała pozostaje włączona
powierzchnia tkanki i płyn pod działaniem
siła odśrodkowa przechodzi przez warstwę osadu i
tkanina jest usuwana na zewnątrz przez otwory w bębnie.
Filtracja odśrodkowa zwykle składa się z
trzy kolejne procesy fizyczne:
1) filtracja z wytworzeniem osadu;
2) zagęszczanie osadów;
3) usunięcie z osadu zatrzymanej cieczy
siły molekularne;

osadzanie odśrodkowe

osadzanie odśrodkowe
Osad odśrodkowy - proces separacji
zawiesiny w wirówkach z bębnami
solidne ściany. Zawiesina jest wstrzykiwana do dolnego
część bębna i pod działaniem siły odśrodkowej
rzucony na ściany. Ściany tworzą warstwę
osad, a ciecz tworzy warstwę wewnętrzną i
przesunięty z bębna wchodzącego do separacji
zawieszenie. Ciecz unosi się do góry
wylewa się na brzeg bębna i jest usuwany
na zewnątrz.
W tym przypadku zachodzą dwa procesy fizyczne:
1) Osadzanie fazy stałej.
2) Zagęszczanie osadów.

Klarowanie odśrodkowe

Klarowanie odśrodkowe - proces separacji
cienkie zawiesiny i roztwory koloidalne. Więc
to samo odbywa się w solidnych bębnach.
Fizycznie, odśrodkowa
wyjaśnienie jest procesem
swobodne osadzanie się cząstek stałych w polu
siły odśrodkowe.
W beczkach z litymi ścianami
przeprowadza się również rozdzielanie emulsji. Pod
działanie składowych siły odśrodkowej
emulsje według gęstości
zlokalizowane w postaci oddzielonych warstw:
zewnętrzna warstwa cieczy o większej gęstości
oraz wewnętrzną warstwę lżejszego płynu.
Ciecze są odprowadzane z bębna oddzielnie.

W laboratoriach klinicznych i sanitarnych
zastosowanie wirowania
oddzielić erytrocyty od
osocze krwi, skrzepy krwi
serum, gęste drobinki z
płynna część moczu itp. Dla
w tym celu, lub
wirówki ręczne, lub
wirówki elektryczne,
którego prędkość obrotowa
Może być dopasowane.
Ultrawirówki, prędkość
obrót wirników których
przekracza 40 000 obr/min,
zwykle używane w
praktyka eksperymentalna
oddzielić organelle
komórki, separacja koloidalna
cząstki, makrocząsteczki,
polimery.

Zastosowanie wirowania w parazytologii

Metoda służy do różnicowania kompleksu
mieszanina krwi, mocz lub kał, a następnie
izolacja z niego robaków na dalszą drogę
badanie pod mikroskopem i utrwalenie materiału. W
proces wirowania dostępny w próbce
pasożyty przechodzą przez filtr i gromadzą się w
dolny stożkowy przedział tuby. Filtruj siatkę
ze specjalnie dobranymi komórkami
w probówce znajduje się w pionie, dzięki czemu
co dzieje się poziomo (bocznie)
filtracja próbki. W rezultacie szorstkie
cząstki niestrawionego pokarmu, błonnik osadza się w
komora mieszania, a pasożyty i ich jaja
swobodnie przechodzić przez filtr. Więc
W ten sposób pasożyty są skoncentrowane w
warstwa powierzchniowa drobnego osadu, oraz
lekarz laboratoryjny może tylko starannie wybrać
próbka do mikroskopii z
automatycznej pipety i nałóż ją na
ślizgać się.

Metoda wirowania w cytologii

Metoda różnicowa
wirowanie służy do
frakcjonowanie komórek, czyli ich stratyfikacja
zawartość na frakcje w zależności od specyfiki
masa różnych organelli i wtrąceń komórkowych.
Aby to zrobić, drobno podzielone komórki są obracane w
aparatura specjalna - ultrawirówka. W
w wyniku odwirowania składniki komórkowe
wytrąca się z roztworu, osadza się
zgodnie z jego gęstością. Bardziej gęsty
struktury są osadzane przy niższych prędkościach
wirowanie i mniej gęste - przy wysokiej
prędkości. Powstałe warstwy są rozdzielane i badane
osobno.

10. Wirowanie w botanice i fizjologii roślin

Wirowanie umożliwia uzyskanie różnych
frakcje cząstek subkomórkowych i zbadaj
właściwości i funkcje każdej frakcji w
osobno. Na przykład z liści szpinaku możesz
wyizoluj chloroplasty, przemyj je
ponowne wirowanie w odpowiednim
podłoże z fragmentów komórek i zbadaj je
zachowanie w różnych eksperymentalnych
warunków lub określić ich skład chemiczny.
Dalej jest to możliwe, stosując różne modyfikacje
technik, zniszcz te plastydy i izoluj
poprzez
wirowanie różnicowe (wielokrotnie
osadzanie cząstek przy różnych wartościach
przyspieszenie) ich elementy składowe. Więc
dzięki temu można było wykazać, że plastydy zawierają
konstrukcje, które są wysoko uporządkowane
struktura, - tzw. ziarna; wszystkie ziarna
są wewnątrz ograniczającego chloroplastu
membrany (membrana chloroplastu). Zalety
ta metoda jest po prostu nieoceniona, ponieważ
ujawnia istnienie
podjednostki funkcjonalne, które tworzą
większe cząstki subkomórkowe; w szczególności,
przy użyciu metody

11. Metoda wirowania w wirusologii

Metoda wirowania gradientu gęstości Brakke'a może być:
być używane zarówno do selekcji, jak i do pozyskiwania
charakterystyka ilościowa wirusów roślinnych. Jak się okazało,
Ta metoda jest obarczona wieloma możliwościami i obecnie jest
szeroko stosowany w dziedzinie wirusologii i molekularnej
biologia. Prowadząc badania metodą
probówka do wirowania gęstości
częściowo wypełniony roztworem, którego gęstość maleje w
kierunek od dołu do menisku. Aby stworzyć gradient
najczęściej stosuje się frakcjonowanie wirusów roślinnych
sacharoza. Przed rozpoczęciem wirowania cząsteczki wirusa mogą:
być rozprowadzone w całej objętości roztworu lub zastosowane do
szczyt gradientu. Brakke zaproponował trzy różne metody
wirowanie w gradiencie gęstości. W izotypowym
(równowagi) proces wirowania trwa do
aż wszystkie cząstki w gradiencie osiągną poziom, na którym gęstość
medium jest równe ich własnej gęstości. Zatem,
frakcjonowanie cząstek następuje w tym przypadku zgodnie z
różnice w ich gęstości. Roztwory sacharozy nie mają
wystarczająca gęstość do izopiknalnego rozdzielenia wielu
wirusy. Dzięki szybkiemu wirowaniu strefowemu wirus
pierwszy zastosowany do wcześniej utworzonego gradientu. Cząstki
każdego rodzaju osadów jednocześnie poprzez gradient w postaci strefy,
lub paski, z prędkością zależną od ich wielkości, kształtu i
gęstość. Wirowanie kończy się, gdy cząstki
nadal sedymentuje. Strefa równowagi
wirowanie podobne do speed zonel
wirowanie, ale w tym przypadku wirowanie

12. Trudności w stosowaniu metody wirowania

Zastosowanie metody wirowania różnicowego
obarczona wieloma trudnościami metodologicznymi. Po pierwsze, w
uwolnienie cząstek może uszkodzić ich strukturę. Więc
konieczne było opracowanie specjalnych metod niszczenia komórek,
który nie spowodowałby uszkodzenia struktury subkomórkowej
ułamki. Po drugie, ponieważ cząstki subkomórkowe mają
błony w trakcie ich uwalniania,
różne efekty osmotyczne. Dlatego za to
aby ultrastruktura badanych obiektów nie uległa zniszczeniu
nawet gdy są izolowane, konieczne jest staranne dobranie składu
środowisko, w którym niszczenie komórek i osadzanie
cząstki. I wreszcie mycie cząstek subkomórkowych
(ponowne zawieszenie ich w medium, a następnie ponowne
wirowanie) może prowadzić do utraty niektórych
zawarte w nich substancje, które pod działaniem sił dyfuzyjnych
idź do rozwiązania.
W związku z tym czasami trudno jest zrozumieć, która z małych cząsteczek
są rzeczywiście elementami badanych konstrukcji, a które
zostały po prostu zaadsorbowane na ich powierzchni podczas procesu izolacji.
Ta sytuacja sprawia, że trudno jest wskazać niektóre
właściwości użytkowe wybranych obiektów.

Kurs pracy

wirowanie

1. Zasada metody

Oddzielanie substancji przez wirowanie opiera się na różnym zachowaniu cząstek w polu odśrodkowym. Zawiesina cząstek umieszczona w probówce jest ładowana do wirnika zamontowanego na wale napędowym wirówki.

W polu odśrodkowym cząstki o różnych gęstościach, kształtach lub rozmiarach osadzają się z różnymi szybkościami. Szybkość sedymentacji zależy odprzyspieszenie odśrodkowe, wprost proporcjonalna do prędkości kątowej wirnika i odległości cząstki od osi obrotu:

a przyspieszenie odśrodkowe będzie wtedy

Ponieważ jeden obrót wirnika to2p radiany, prędkość kątową wirnika w obrotach na minutę można zapisać jako:

Przyspieszenie odśrodkowe jest zwykle wyrażane w jednostkachg i zadzwoniłemwzględne przyspieszenie odśrodkowe , tj.

lub

Wymieniając warunki oddzielania cząstek, należy wskazać prędkość obrotową i promień wirnika oraz czas wirowania. Przyspieszenie odśrodkowe jest zwykle wyrażane w jednostkachg , obliczona ze średniego promienia obrotu słupa cieczywprobówka wirówkowa. Na podstawie tego równania Dole i Kotzias opracowali nomogram wyrażający zależność GCF od prędkości i promienia wirnika r.

Ryż. 2 .1. Nomogram do obliczania przyspieszenia odśrodkowego.

Aby określić O, wartości promienia i prędkość obrotu wirnika na skrajnych skalach są połączone linią prostą; punkt przecięcia tej prostej ze skalą średnią daje pożądaną wartość przyspieszenia odśrodkowego. Należy pamiętać, że prawa kolumna liczb na skali O odpowiada prawej kolumnie liczb na skali prędkości wirnika; lewo lewo.

Szybkość sedymentacji kulistych cząstek zależy nie tylko od przyspieszenia odśrodkowego, ale także od gęstości i promienia samych cząstek oraz od lepkości ośrodka zawiesiny. Czas potrzebny do sedymentacji kulistej cząstki w ciekłym ośrodku od menisku ciekłego do dna probówki wirówkowej jest odwrotnie proporcjonalny do szybkości sedymentacji i jest określony następującym równaniem:

gdziet - czas sedymentacji w sekundach,rj- lepkość medium,Gh- promień cząstki, rh- gęstość cząstek, p - średnia gęstość, gm- odległość od osi obrotu do menisku cieczy, gd- odległość od osi obrotu do dna rury.

Jak wynika z równania, przy danej prędkości wirnika czas potrzebny do sedymentacji jednorodnych kulistych cząstek jest odwrotnie proporcjonalny do kwadratu ich promieni i różnicy gęstości cząstek i ośrodka oraz jest wprost proporcjonalny do lepkości ośrodka . W związku z tym mieszanina niejednorodnych, w przybliżeniu kulistych cząstek, różniących się gęstością i wielkością, może być rozdzielona albo ze względu na różne czasy ich osiadania na dnie rury przy danym przyspieszeniu, albo ze względu na rozkład cząstek osiadających wzdłuż rury , który jest ustalany po pewnym czasie. Przy rozdzielaniu substancji należy wziąć pod uwagę tak ważne czynniki, jak gęstość i lepkość medium. Opisane metody mogą oddzielać organelle komórkowe od homogenatów tkankowych. Główne składniki komórki odkładają się w następującej kolejności: najpierw całe komórki i ich fragmenty, następnie jądra komórkowe, chloroplasty, mitochondria, lizosomy, mikrosomy, a na końcu rybosomy. Osiadanie cząstek niesferycznych nie jest zgodne z równaniem, więc cząstki o tej samej masie, ale różnych kształtach osadzają się z różnymi prędkościami. Cecha ta jest wykorzystywana w badaniach z wykorzystaniem ultrawirowania konformacji makrocząsteczek.

polega na przeznaczeniu materiału biologicznego do kolejnych badań biochemicznych. W tym przypadku można pobrać duże ilości wyjściowego materiału biologicznego, na przykład inokulacje komórek drobnoustrojów z hodowli okresowych lub ciągłych, a także inokulacje komórek roślinnych i zwierzęcych z hodowli tkanek i osocza krwi. Za pomocą wirowania preparatywnego izoluje się dużą liczbę cząstek komórkowych w celu zbadania ich morfologii, struktury i aktywności biologicznej. Metodę stosuje się również do izolacji takich biologicznych makrocząsteczek jak DNA i białka z wcześniej oczyszczonych preparatów.

Wirowanie analityczne Służy głównie do badania czystych lub praktycznie czystych preparatów makrocząsteczek lub cząstek, takich jak rybosomy. W tym przypadku stosuje się niewielką ilość materiału, a sedymentację badanych cząstek rejestruje się w sposób ciągły za pomocą specjalnych układów optycznych. Metoda pozwala na uzyskanie danych o czystości, masie cząsteczkowej i strukturze materiału. Na studiach licencjackich znacznie częściej stosuje się wirowanie preparatywne niż wirowanie analityczne, dlatego skupimy się na nim bardziej szczegółowo, chociaż obie metody opierają się na wspólnych zasadach.

2. Wirowanie preparatywne

2 .1 wirowanie różnicowe

Ta metoda opiera się na różnicach w szybkości sedymentacji cząstek różniących się między sobą rozmiarem i gęstością. Oddzielany materiał, na przykład homogenat tkankowy, jest odwirowywany ze stopniowym wzrostem przyspieszenia wirowania, które jest tak dobrane, aby na każdym etapie osadzała się pewna frakcja na dnie probówki. Pod koniec każdego etapu osad oddziela się od supernatantu i przemywa kilka razy, aby ostatecznie otrzymać czystą wytrąconą frakcję. Niestety praktycznie niemożliwe jest uzyskanie absolutnie czystego osadu; Aby zrozumieć, dlaczego tak się dzieje, przejdźmy do procesu, który zachodzi w probówce wirówkowej na początku każdego etapu wirowania.

Po pierwsze, wszystkie cząstki homogenatu są równomiernie rozłożone w objętości probówki wirówkowej, więc nie jest możliwe uzyskanie czystych preparatów osadów najcięższych cząstek w jednym cyklu wirowania: pierwszy utworzony osad zawiera głównie najcięższe cząstki, ale, dodatkowo pewna ilość wszystkich początkowych składników. Wystarczająco czysty preparat ciężkich cząstek można uzyskać tylko przez ponowne zawieszenie i odwirowanie początkowego osadu. Dalsze wirowanie supernatantu z późniejszym wzrostem przyspieszenia wirowego prowadzi do sedymentacji cząstek o średniej wielkości i gęstości, a następnie do sedymentacji najmniejszych cząstek o najniższej gęstości. Na ryc. 2.3 jest schematem frakcjonowania homogenatu wątroby szczura.

Ryż. 2.2. Wirowanie różnicowe zawiesiny cząstek w polu odśrodkowym.

Po pierwsze, cząstki są równomiernie rozprowadzane w całej objętości probówki wirówkowej. (a): podczas wirowania cząstki sedymentują zgodnie z ich wielkością i kształtem (b - mi).

Ryż. 2.3. Schemat frakcjonowania homogenatu wątroby szczura na frakcje subkomórkowe.

Wirowanie różnicowe wydaje się być najczęstszą metodą izolacji organelli komórkowych z homogenatów tkankowych. Ta metoda jest najskuteczniej stosowana do oddzielania takich organelli komórkowych, które znacznie różnią się od siebie wielkością i gęstością. Ale nawet w tym przypadku otrzymane frakcje nigdy nie są całkowicie jednorodne, a do ich dalszego rozdzielania stosuje się inne metody, opisane poniżej. Metody te, oparte na różnicach w gęstości organelli, zapewniają wydajniejszą separację poprzez wirowanie w roztworach o ciągłym lub stopniowym gradiencie gęstości. Wadą tych metod jest to, że uzyskanie gradientu gęstości roztworu wymaga czasu.

2.2 Wirowanie z prędkością strefową

Metoda strefowo-prędkościowa lub, jak to się nazywa,s-wirowanie strefowe, polega na ułożeniu warstwy badanej próbki na powierzchni roztworu z ciągłym gradientem gęstości. Próbka jest następnie odwirowywana, aż cząstki zostaną rozprowadzone wzdłuż gradientu w dyskretnych strefach lub pasmach. Tworząc gradient gęstości, można uniknąć mieszania się stref wynikających z konwekcji. Metoda szybkiego wirowania strefowego służy do oddzielania hybryd RNA-DNA, podjednostek rybosomów i innych składników komórkowych.

Ryż. 2 .4. Szybkość i izopikalna separacja cząstek w gradiencie gęstości. Przed rozpoczęciem wirowania zawiesina cząstek jest nakładana na gradient gęstości cieczy (a). Przy wirowaniu z dużą prędkością cząstki nie osiągają punktu izopikalnego, a przy separacji izopikalnej wirowanie kontynuuje się do momentu, gdy badane cząstki nie osiągną strefy o odpowiedniej gęstości. (b).

2.3 Wirowanie izopikniczne

Wirowanie izopyknic prowadzi się zarówno w gradiencie gęstości, jak iw zwykły sposób. Jeżeli wirowanie nie jest przeprowadzane w gradiencie gęstości, preparat najpierw odwirowuje się tak, aby cząstki o masie cząsteczkowej większej niż cząstki badane osiadły. Te ciężkie cząstki są odrzucane, a próbka jest zawieszana w ośrodku o gęstości takiej samej jak frakcja, która ma być izolowana, a następnie odwirowywana, aż badane cząstki opadną na dno probówki, a cząstki o mniejszej gęstości unoszą się do powierzchnia cieczy...

Ryż. 2.5. Separacja izopikalna bez gradientu gęstości.

Przed wirowaniem cząstki są równomiernie rozłożone w całej objętości probówki wirówkowej (a). Po odwirowaniu lżejsze cząsteczki unoszą się na górę, podczas gdy ciężkie osiadają na dnie probówki. (b)

Innym sposobem jest nałożenie próbki na powierzchnię roztworu z ciągłym gradientem gęstości obejmującym zakres gęstości wszystkich składników mieszaniny. Wirowanie prowadzi się do momentu, gdy gęstość cząstek w stanie wyporu będzie równa gęstości odpowiednich stref, tj. dopóki cząstki nie zostaną rozdzielone na strefy. Metoda ta nazywana jest strefową izopyknicą lub wirowaniem rezonansowym, ponieważ chodzi tu o gęstość wyporu, a nie o wielkość czy kształt cząstek. Na gęstość, przy której cząstki tworzą pasma izopikalne, ma wpływ charakter ośrodka zawiesiny; cząsteczki mogą być przepuszczalne dla niektórych związków w roztworze i nieprzepuszczalne dla innych lub mogą przyłączać cząsteczki roztworu. Podczas korzystania z rotora strefowego mitochondria, lizosomy, peroksysomy i mikrosomy są skoncentrowane w pasmach z 42%, 47%, 47% i 27% sacharozy, co odpowiada gęstości 1,18, 1,21, 1,21 i 1,10 g-cm-3 odpowiednio. Gęstość organelli subkomórkowych zależy również od ich selektywnego pobierania niektórych związków. Wprowadzenie szczurom niehemolitycznego detergentu TritonWR-1339 prowadzi do wzrostu wielkości i zmniejszenia gęstości lizosomów wątrobowych; gęstość mitochondriów i peroksysomów pozostaje niezmieniona. Pomimo tego, że właściwości sedymentacyjne lizosomów z reguły się nie zmieniają, ich gęstość równowagowa w gradiencie sacharozy spada z 1,21 do 1,1, co prowadzi do odpowiedniego oddzielenia frakcji lizosomalno-peroksysomalnej. Cecha ta jest wykorzystywana w ilościowej separacji lizosomów, mitochondriów i peroksysomów, polegającej na usunięciu z jednorodnego ośrodka wszystkich cząstek o gęstości większej niż mikrosomów, a następnie izopikalnym wirowaniu wytrąconych ciężkich cząstek.

2.4 Równowagowe wirowanie w gradiencie gęstości

Sole metali ciężkich, takich jak rubid lub cez, a także roztwory sacharozy są wykorzystywane do tworzenia gradientu gęstości. Próbkę, taką jak DNA, miesza się ze stężonym roztworem chlorku cezu. Zarówno substancja rozpuszczona, jak i rozpuszczalnik są początkowo równomiernie rozprowadzone w całej objętości. Podczas wirowania ustala się równowagowy rozkład stężenia, a w konsekwencji gęstośćCsCl, ponieważ jony cezu mają dużą masę. Pod wpływem przyspieszenia odśrodkowego cząsteczki DNA ulegają redystrybucji, gromadząc się w postaci wydzielonej strefy w części probówki o odpowiadającej im gęstości. Metoda stosowana jest głównie w wirowaniu analitycznym i została wykorzystana przez Meselsona i Stahla do badania mechanizmu replikacji DNA.MI. coli . Wirowanie w gradiencie gęstości równowagi jest również jedną z metod rozdzielania i badania lipoprotein ludzkiego osocza.

2. 5 Kształtowanie i wydobywanie gradientów

2.5.1 Charakter gradientów

Do tworzenia gradientów gęstości roztworów najczęściej stosuje się roztwory sacharozy, czasami o ustalonym pH. W niektórych przypadkach dobrą separację uzyskuje się, gdy stosuje się ją zamiast zwykłej wody.D2 0. W tabeli. 2.1 pokazuje właściwości niektórych roztworów sacharozy.

Stężenie, %

Właściwości roztworów sacharozy

Wybór gradientu jest podyktowany konkretnymi zadaniami frakcjonowania. Czyli na przykład fikol, produkowany przez firmęApteka W porządku Środki chemiczne, może zastąpić sacharozę w przypadkach, gdy konieczne jest wytworzenie gradientów o dużej gęstości i niskim ciśnieniu osmotycznym. Kolejną zaletą ficolu jest to, że nie przenika przez błony komórkowe. Sole metali ciężkich, takie jak rubid i cez, są używane do tworzenia gradientów o większej gęstości, jednak ze względu na działanie korozyjneCsCltakie gradienty są stosowane tylko w wirnikach wykonanych z metali odpornych, takich jak tytan.

2.5.2 Technika stopniowego gradientu gęstości

Aby stworzyć gradient gęstości, kilka roztworów o stopniowo zmniejszającej się gęstości jest ostrożnie wprowadzanych do probówki wirówkowej za pomocą pipety. Następnie na najwyższej warstwie, która ma najmniejszą gęstość, próbkę układa się warstwowo w postaci wąskiej strefy, po czym probówkę wiruje się. Gładkie gradienty liniowe można uzyskać przez wygładzanie stopniowych gradientów podczas długotrwałego stania roztworu. Proces można przyspieszyć, delikatnie mieszając zawartość tuby drutem lub delikatnie potrząsając tubką.

2.5.3 Technika tworzenia gładkiego gradientu gęstości

W większości przypadków do stworzenia gładkiego gradientu gęstości używa się specjalnego urządzenia. Składa się z dwóch cylindrycznych naczyń o ściśle określonej identycznej średnicy, skomunikowanych ze sobą na dnie szklaną rurką z zaworem sterującym, co pozwala na regulację proporcji mieszania zawartości obu naczyń. Jedna z nich wyposażona jest w mieszadło i posiada wylot, przez który roztwór przepływa do probówek wirówkowych. Gęstszy roztwór umieszcza się w mikserze; drugi cylinder jest wypełniony roztworem o mniejszej gęstości. Wysokość kolumny roztworów w obu cylindrach jest ustawiona w taki sposób, aby ciśnienie hydrostatyczne w nich było takie samo. Gęstszy roztwór jest stopniowo odprowadzany z mieszalnika do rurek wirówki i jednocześnie jest zastępowany przez równą objętość roztworu o niższej gęstości wchodzącej do mieszalnika z drugiego cylindra przez zawór sterujący. Jednorodność roztworu w mieszalniku zapewnia ciągłe mieszanie roztworu mieszadłem. Gdy roztwór jest spuszczany do probówek wirówkowych, jego gęstość spada i powstaje liniowy gradient gęstości w probówkach. Gradienty nieliniowe można tworzyć za pomocą systemu składającego się z dwóch walców o nierównej średnicy.

Do tworzenia gradientów gęstości o różnym nachyleniu stosuje się układ dwóch mechanicznie sterowanych strzykawek, które wypełnione są roztworami o nierównej gęstości. Zmieniając względną prędkość tłoków można tworzyć różne gradienty.

2.5.4 Ekstrakcja gradientów z probówek wirówkowych

Po zakończeniu wirowania i rozdzieleniu cząstek powstałe strefy należy usunąć. Odbywa się to na kilka sposobów, najczęściej metodą przemieszczenia. Probówkę wirówkową przekłuwa się u podstawy, a do jej dolnej części powoli wprowadza się bardzo gęsty ośrodek, na przykład 60-70% roztwór sacharozy. Roztwór górny jest przemieszczany i frakcje są zbierane za pomocą strzykawki, pipety lub specjalnego urządzenia połączonego rurką z kolektorem frakcji. Jeśli rurki wykonane są z celuloidu lub nitrocelulozy, frakcje są ekstrahowane poprzez nacięcie rurki specjalnym ostrzem. W tym celu umocowaną w statywie probówkę wirówkową nacina się bezpośrednio pod wybraną strefą, a frakcję odsysa się strzykawką lub pipetą. Przy odpowiedniej konstrukcji urządzenia tnącego straty roztworu będą minimalne. Zbieranie frakcji odbywa się również poprzez nakłuwanie dna probówki cienką wydrążoną igłą. Krople spływające z probówki przez igłę są zbierane w kolektorze frakcji do dalszej analizy.

2.5.5 Wirówki preparatywne i ich zastosowania

Wirówki preparatywne można podzielić na trzy główne grupy: wirówki ogólnego przeznaczenia, wirówki szybkoobrotowe i ultrawirówki preparatywne.Wirówki ogólnego przeznaczenia dać maksymalną prędkość 6000 obr/min-1 i OCU do 6000g . Różnią się od siebie jedynie pojemnością i posiadają szereg wymiennych wirników: kątowe i z wiszącymi szkłami. Jedną z cech tego typu wirówek jest ich duża pojemność – od 4 do 6 dm3 co pozwala załadować je nie tylko probówkami wirówkowymi 10,50 i 100 cm3 , ale także statki o pojemności do 1,25 dm3 . We wszystkich tego typu wirówkach wirniki są sztywno osadzone na wale napędowym, a probówki wraz z zawartością muszą być starannie wyważone i różnić się masą nie większą niż 0,25 g. powinny być ustawione symetrycznie względem siebie. inne, zapewniając w ten sposób równomierne rozłożenie probówek względem osi obrotu wirnika.

Wirówki szybkoobrotowe dać maksymalną prędkość 25 000 obr/min-1 i OCU do 89000g. Komora wirnika jest wyposażona w system chłodzenia, który zapobiega nagrzewaniu się, które powstaje w wyniku tarcia podczas obrotu wirnika. Z reguły wirówki szybkoobrotowe mają pojemność 1,5 dm3 i są wyposażone w wymienne wirniki, zarówno kątowe, jak i z wiszącymi szkłami.

Ultrawirówki preparatywne dają prędkość maksymalną do 75 000 obr/min-1 i maksymalne przyspieszenie odśrodkowe 510 000g . Wyposażone są zarówno w lodówkę, jak i jednostkę próżniową, aby zapobiec przegrzaniu wirnika z powodu jego tarcia z powietrzem. Wirniki takich wirówek wykonane są z wysokowytrzymałych stopów aluminium lub tytanu. Wirniki ze stopu aluminium są stosowane głównie, jednak w przypadkach, gdy wymagane są szczególnie wysokie prędkości, stosuje się wirniki tytanowe. Aby zredukować wibracje wynikające z niewyważenia wirnika spowodowanego nierównomiernym wypełnieniem probówek wirówkowych, ultrawirówki mają elastyczny wał. Probówki wirówkowe i ich zawartość należy dokładnie wyważyć z dokładnością do 0,1 g. Podobne wymagania należy przestrzegać przy ładowaniu wirników wirówek do celów ogólnych.

2.6 Konstrukcja wirników

2.6.1 Wirniki kątowe i wirniki z wiszącymi kubełkami

Wirniki wirówek preparatywnych są zwykle dwojakiego rodzaju - wiaderkami kątowymi i wiszącymi. Nazywa się je kątowymi, ponieważ umieszczone w nich rurki wirówkowe są zawsze ustawione pod pewnym kątem do osi obrotu. W wirnikach z wiszącymi szkłami probówki są instalowane pionowo, a obracane pod działaniem powstałej siły odśrodkowej przesuwają się do pozycji poziomej; kąt nachylenia do osi obrotu wynosi 90°.

W wirnikach kątowych odległość pokonywana przez cząstki do odpowiedniej ścianki probówki jest bardzo mała, dlatego sedymentacja zachodzi stosunkowo szybko. Po zderzeniu ze ściankami probówki cząstki ześlizgują się i tworzą osad na dnie. Podczas wirowania powstają przepływy konwekcyjne, które znacznie komplikują oddzielanie cząstek o podobnych właściwościach sedymentacyjnych. Niemniej jednak wirniki o podobnej konstrukcji są z powodzeniem stosowane do oddzielania cząstek, których szybkość sedymentacji jest bardzo zróżnicowana.

W wirnikach z wiszącymi miseczkami obserwuje się również zjawiska konwekcji, ale nie są one tak wyraźne. Konwekcja jest wynikiem tego, że pod działaniem przyśpieszenia odśrodkowego cząstki osiadają w kierunku nieściśle prostopadłym do osi obrotu, a zatem, podobnie jak w wirnikach kątowych, uderzają o ścianki probówki i przesuwają się do dół.

Efekty konwekcji i wirowania można w pewnym stopniu uniknąć, stosując rury o przekroju sektorowym w wirnikach wiszących kubkowych i regulując prędkość wirnika; wymienionych powyżej, metoda wirowania w gradiencie gęstości jest również pozbawiona wad.

2.6.2 Wirniki ciągłe

Wirniki ciągłe są przeznaczone do szybkiego frakcjonowania stosunkowo małych ilości materiału stałego z zawiesin o dużej objętości, na przykład do izolacji komórek z pożywek hodowlanych. Podczas wirowania do wirnika w sposób ciągły dodawana jest zawiesina cząstek; przepustowość rotora zależy od charakteru osadzanego preparatu i waha się od 100 cm3 do 1 dm²3 w 1 min. Osobliwością wirnika jest to, że jest to izolowana komora o specjalnej konstrukcji; jego zawartość nie komunikuje się ze środowiskiem zewnętrznym, a zatem nie jest zanieczyszczona ani rozpylona.

2.6.3 Wirniki strefowe lub Anderson

Ryż. 2 .6. Etapy wirowania (a- mi) w rotorze strefowym

Wirniki strefowe są wykonane ze stopów aluminium lub tytanu, które są w stanie wytrzymać bardzo duże przyspieszenia odśrodkowe. Zwykle mają cylindryczną wnękę, zamkniętą zdejmowaną pokrywą. Wewnątrz wnęki, na osi obrotu, znajduje się osiowa rura, na którą nakładana jest dysza z łopatkami, dzieląca wnękę wirnika na cztery sektory. Łopatki lub przegrody mają promieniowe kanały, przez które wprowadzany jest gradient od osiowej rury do obrzeża wirnika. Dzięki takiej konstrukcji łopatek konwekcja jest ograniczona do minimum.

Napełnianie wirnika odbywa się, gdy obraca się on z prędkością około 3000 obr/min-1 . Wstępnie utworzony gradient jest pompowany do wirnika, zaczynając od warstwy o najniższej gęstości, która jest równomiernie rozłożona na obwodzie wirnika i jest utrzymywana na jego zewnętrznej ścianie prostopadle do osi obrotu dzięki sile odśrodkowej. Wraz z późniejszym dodawaniem warstw gradientu o większej gęstości następuje ciągłe przesunięcie w kierunku środka warstw o mniejszej gęstości. Po wpompowaniu całego gradientu do wirnika, jest on wypełniany do pełnej objętości roztworem zwanym „poduszką”, którego gęstość jest taka sama lub nieznacznie przekracza najwyższą gęstość wstępnie uformowanego gradientu.

Następnie przez rurkę osiową próbkę testową układa się warstwami, który jest przemieszczany z tuby do objętości wirnika za pomocą roztworu o mniejszej gęstości, w tym samym czasie ta sama objętość „poduszki” jest usuwana z peryferii. Po wszystkich tych procedurach prędkość obrotowa wirnika zostaje doprowadzona do prędkości roboczej i przez wymagany okres czasu przeprowadza się frakcjonowanie strefowe lub strefowo-izopikniczne.. Ekstrakcja frakcji odbywa się przy prędkości wirnika 3000 obr/min-1 . Zawartość wirnika jest przesuwana poprzez dodanie „poduszki” z obwodu, przede wszystkim mniej gęste warstwy są przemieszczone. Dzięki specjalnej konstrukcji osiowego kanału wirnika Andersona nie dochodzi do mieszania stref podczas ich przemieszczania. Gradient wychodzący jest przepuszczany przez urządzenie rejestrujące, na przykład celę spektrofotometru, za pomocą którego można określić zawartość białka metodą absorpcji przy 280 nm, lub przez specjalny detektor radioaktywności, po czym zbierane są frakcje.

Wydajność wirników strefowych stosowanych przy średnich prędkościach waha się od 650 do 1600 cm3 , co pozwala na uzyskanie dość dużej ilości materiału. Wirniki strefowe służą do usuwania zanieczyszczeń białkowych z różnych preparatów oraz do izolowania i oczyszczania mitochondriów, lizosomów, polisomów i białek.

2.6.4 Analiza frakcji subkomórkowych

Właściwości preparatu cząstek subkomórkowych otrzymanych przez frakcjonowanie można przypisać właściwościom samych cząstek tylko wtedy, gdy preparat nie zawiera zanieczyszczeń. Dlatego zawsze konieczna jest ocena czystości otrzymanych preparatów. Wydajność homogenizacji oraz obecność zanieczyszczeń w preparacie można określić za pomocą badania mikroskopowego. Jednak brak widocznych zanieczyszczeń nie jest jeszcze wiarygodnym dowodem na czystość leku. W celu ilościowego określenia czystości otrzymanego preparatu poddaje się go analizie chemicznej, która pozwala określić zawartość w nim białek lub DNA, określić jego aktywność enzymatyczną w miarę możliwości oraz właściwości immunologiczne.

Analiza dystrybucji enzymów we frakcjonowanych tkankach opiera się na dwóch ogólnych zasadach. Pierwszym z nich jest to, że wszystkie cząstki danej populacji subkomórkowej zawierają ten sam zestaw enzymów. Drugi zakłada, że każdy enzym jest zlokalizowany w określonym miejscu w komórce. Gdyby ta pozycja była prawdziwa, enzymy mogłyby działać jako markery dla odpowiednich organelli: na przykład oksydaza cytochromowa i oksydaza monoaminowa służyłyby jako enzymy markerowe mitochondrialne, hydrolazy kwaśne jako markery lizosomów, katalaza jako marker peroksysomów, a glukoza-6- fosfataza - marker błony mikrosomalnej. Okazało się jednak, że niektóre enzymy, takie jak dehydrogenaza jabłczanowa,R -glukuronidaza, NADP' H-cytochrom-c-reduktaza, są zlokalizowane w więcej niż jednej frakcji. Dlatego do wyboru enzymów-markerów frakcji subkomórkowych w każdym konkretnym przypadku należy podchodzić z dużą ostrożnością. Co więcej, brak enzymu markerowego nie oznacza braku odpowiednich organelli. Jest prawdopodobne, że podczas frakcjonowania enzym jest tracony przez organelle lub jest hamowany lub inaktywowany; dlatego dla każdej frakcji zwykle określa się co najmniej dwa enzymy markerowe.

Frakcja

2.7 Frakcjonowanie przez wirowanie różnicowe

2.7.1 Prezentacja wyników

Wyniki uzyskane z frakcjonowania tkanek najdogodniej przedstawia się w postaci wykresów. Dlatego badając rozmieszczenie enzymów w tkankach, najlepiej przedstawić dane w postaci histogramów, które umożliwiają wizualną ocenę wyników eksperymentów.

Aktywność enzymatyczną zawartości białka w próbce określa się zarówno w oryginalnym homogenacie, jak iw każdej wyodrębnionej frakcji subkomórkowej oddzielnie. Całkowita aktywność enzymatyczna i zawartość białka we frakcjach nie powinny znacząco różnić się od odpowiednich wartości w oryginalnym homogenacie.

Następnie aktywność enzymatyczną i zawartość białka w każdej frakcji oblicza się w % całkowitego plonu, na podstawie którego wykonywany jest histogram. Względną ilość białka w każdej frakcji wykreśla się kolejno wzdłuż osi odciętych w kolejności ich izolacji, a względną aktywność właściwą każdej frakcji wykreśla się wzdłuż osi rzędnych. W ten sposób aktywność enzymatyczną każdej frakcji określa się z obszaru kolumn.

2.7.2 Ultrawirowanie analityczne

W przeciwieństwie do wirowania preparatywnego, którego celem jest oddzielenie substancji i ich oczyszczenie, ultrawirowanie analityczne służy głównie do badania właściwości sedymentacyjnych makrocząsteczek biologicznych i innych struktur. Dlatego w wirowaniu analitycznym stosuje się wirniki i systemy rejestrujące o specjalnej konstrukcji: pozwalają na ciągłe monitorowanie sedymentacji materiału.w pole odśrodkowe.

Ultrawirówki analityczne mogą osiągać prędkość do 70 000 obr./min -1 , tworząc przyspieszenie odśrodkowe do 500 000g . Ich wirnik z reguły ma kształt elipsoidy i jest połączony sznurkiem z silnikiem, co umożliwia zmianę prędkości obrotowej wirnika. Wirnik obraca się w komorze próżniowej wyposażonej w urządzenie chłodnicze i posiada dwie komórki analityczne i wyważające, które są zainstalowane w wirówce ściśle pionowo, równolegle do osi obrotu. Cela równoważąca służy do równoważenia celi analitycznej i jest metalowym blokiem z precyzyjnym systemem. Posiada również dwa otwory indeksowe znajdujące się w ściśle określonej odległości od osi obrotu, za pomocą których wyznaczane są odpowiednie odległości w komórce analitycznej. Komórka analityczna, zwykle 1 cm 3 , ma formę sektorową. Prawidłowo zainstalowany w wirniku, mimo że jest ustawiony w pozycji pionowej, działa na tej samej zasadzie, co wirnik z wiszącymi kubełkami, tworząc niemal idealne warunki sedymentacji. Na końcach celi analitycznej znajdują się okienka ze szkłami kwarcowymi. Ultrawirówki analityczne wyposażone są w układy optyczne, które umożliwiają monitorowanie sedymentacji cząstek podczas całego okresu wirowania. W określonych odstępach czasu osadzony materiał można fotografować. Podczas frakcjonowania białek i DNA sedymentację monitoruje się przez absorpcję w ultrafiolecie, a w przypadkach, gdy badane roztwory mają różne współczynniki załamania, przy użyciu systemu Schlierena lub systemu interferencji Rayleigha. Dwie ostatnie metody opierają się na fakcie, że gdy światło przechodzi przez przezroczysty roztwór składający się ze stref o różnych gęstościach, światło załamuje się na granicy strefy. Podczas sedymentacji powstaje granica między strefami z ciężkimi i lekkimi cząsteczkami, która działa jak soczewka refrakcyjna; w tym przypadku na kliszy fotograficznej używanej jako detektor pojawia się pik. W trakcie sedymentacji przesuwa się granica, a w konsekwencji szczyt, którego prędkość można wykorzystać do oceny szybkości sedymentacji materiału. Systemy interferometryczne są bardziej czułe niż systemy Schlierena. Ogniwa analityczne są jednosektorowe, które są używane najczęściej, oraz dwusektorowe, które są wykorzystywane do badań porównawczych rozpuszczalnika i substancji rozpuszczonej.

W biologii ultrawirowanie analityczne służy do określania mas cząsteczkowych makrocząsteczek, sprawdzania czystości uzyskanych próbek oraz badania zmian konformacyjnych w makrocząsteczkach.

2.8 Zastosowanie ultrawirowania analitycznego

2.8.1 Oznaczanie mas cząsteczkowych

Istnieją trzy główne metody określania mas cząsteczkowych przy użyciu ultrawirowania analitycznego: oznaczanie szybkości sedymentacji, metoda równowagi sedymentacji i metoda aproksymacji równowagi sedymentacji.

Oznaczanie masy cząsteczkowej za pomocą szybkości sedymentacji - jest to najczęstsza metoda. Wirowanie odbywa się z dużymi prędkościami, dzięki czemu cząstki, początkowo równomiernie rozłożone w całej objętości, zaczynają poruszać się w porządku wzdłuż promienia od środka obrotu. Pomiędzy obszarem rozpuszczalnika, już wolnym od cząstek, a jego częścią, która je zawiera, tworzy się wyraźna granica. Granica ta porusza się podczas wirowania, co umożliwia wyznaczenie szybkości sedymentacji cząstek jedną z powyższych metod, rejestrując ten ruch na płycie fotograficznej.

Szybkość sedymentacji zależy od następującej zależności:

gdzieX - odległość od osi obrotu w cm,

t - czas w s,

w- prędkość kątowa w rad-s -1 ,

s - współczynnik sedymentacji „cząsteczki.

Współczynnik sedymentacji to prędkość na jednostkę przyspieszenia, mierzona wJednostki Seedberg ; 1 jednostka swedberga równa się 10 _13 z. Wartość numerycznaszależy od masy cząsteczkowej i kształtu cząstek i jest wartością charakterystyczną dla danej cząsteczki lub struktury supramolekularnej. Na przykład współczynnik sedymentacji lizozymu wynosi 2,15S; katal aza ma współczynnik sedymentacji 11,35S, podjednostki rybosomów bakteryjnych - od 30 do 50S, oraz podjednostki rybosomów eukariotycznych - od 40 do 60S.

gdzieM to masa cząsteczkowa cząsteczki,R jest stałą gazową,T to temperatura bezwzględna,sjest współczynnikiem sedymentacji cząsteczki,D jest współczynnikiem dyfuzji cząsteczki,v - częściowa objętość właściwa, którą można uznać za objętość zajmowaną przez jeden gram substancji rozpuszczonej, p - gęstość rozpuszczalnika.

Metoda bilansowania sedymentacji. Wyznaczanie mas cząsteczkowych tą metodą odbywa się przy stosunkowo niskich prędkościach obrotowych wirnika, rzędu 7000-8000 obr/min -1 aby cząsteczki o dużej masie cząsteczkowej nie osiadały na dnie. Ultrawirowanie prowadzi się do momentu osiągnięcia przez cząstki równowagi, która ustala się pod działaniem sił odśrodkowych z jednej strony i sił dyfuzyjnych z drugiej, to znaczy do momentu, gdy cząstki przestaną się poruszać. Następnie zgodnie z uzyskanym gradientem stężeń masę cząsteczkową substancji oblicza się według wzoru

gdzieR jest stałą gazową,T - temperatura bezwzględna, o - prędkość kątowa, p - gęstość rozpuszczalnika,v - częściowa objętość właściwa,z X orazz 2 jest stężenie substancji rozpuszczonej na odległościachG G i g 2 od osi obrotu.

Wadą tej metody jest to, że osiągnięcie równowagi sedymentacyjnej zajmuje dużo czasu - od kilku dni do kilku tygodni przy ciągłej pracy wirówki.

Metodą dochodzenia do równowagi sedymentacyjnej było: opracowany w celu pozbycia się wad poprzedniej metody, związanych z dużym nakładem czasu potrzebnego na „wyrównanie”. Za pomocą tej metody można określić masy cząsteczkowe, gdy odwirowany roztwór znajduje się w stanie zbliżenia do równowagi. Po pierwsze, makrocząsteczki są równomiernie rozmieszczone w całej objętości kuwety analitycznej; następnie, w miarę postępu wirowania, cząsteczki osadzają się, a gęstość roztworu w obszarze łąkotki stopniowo maleje. Zmiana gęstości jest dokładnie rejestrowana, a następnie, na podstawie skomplikowanych obliczeń obejmujących dużą liczbę zmiennych, masę cząsteczkową danego związku określa się za pomocą wzorów:

gdzieR jest stałą gazową,T to temperatura bezwzględna,v - cząstkowa objętość właściwa, p - gęstość rozpuszczalnika,dcldr - gradient stężenia makrocząsteczek, g mi g d- odległość odpowiednio do menisku i dna rurki, s mi z d- stężenie makrocząsteczek odpowiednio w menisku i na dnie probówki,M m orazM R -wartości mas cząsteczkowych, określone przez rozkład stężenia substancji odpowiednio w menisku i dnie probówki.

2.8.2 Ocena czystości preparatów

Ultrawirowanie analityczne jest szeroko stosowane do oceny czystości preparatów DNA, wirusów i białek. Czystość preparatów jest niewątpliwie bardzo ważna w przypadkach, gdy wymagane jest dokładne określenie masy cząsteczkowej cząsteczki. W większości przypadków jednorodność preparatu można ocenić na podstawie charakteru granicy sedymentacji, stosując metodę szybkości sedymentacji: jednorodny preparat zwykle daje jedną ostro określoną granicę. Zanieczyszczenia obecne w preparacie pojawiają się jako dodatkowy wierzchołek lub bark; określają również asymetrię głównego piku.

2.8.3 Badanie zmian konformacyjnych w makrocząsteczkach

Kolejnym obszarem zastosowania ultrawirowania analitycznego jest badanie zmian konformacyjnych w makrocząsteczkach. Na przykład cząsteczka DNA może być jedno- lub dwuniciowa, liniowa lub kolista. Pod wpływem różnych związków lub w podwyższonych temperaturach DNA ulega wielu odwracalnym i nieodwracalnym zmianom konformacyjnym, które można określić zmieniając szybkość sedymentacji próbki. Im bardziej zwarta cząsteczka, tym niższy jej współczynnik tarcia w roztworze i na odwrót: im mniej zwarta, tym większy współczynnik tarcia, a co za tym idzie, wolniejsza sedymentacja. Zatem różnice w szybkości sedymentacji próbki przed i po różnych oddziaływaniach na nią umożliwiają wykrycie zmian konformacyjnych zachodzących w makrocząsteczkach.

W białkach allosterycznych, takich jak np. transkarbamoylaza asparaginianowa, zmiany konformacyjne zachodzą w wyniku ich wiązania z substratem i małymi ligandami. Dysocjację białka na podjednostki można wywołać przez potraktowanie go substancjami takimi jak mocznik lub parachlorortęcibenzoesan. Wszystkie te zmiany można łatwo monitorować za pomocą analitycznego ultrawirowania.

Wirowanie to rozdzielanie mieszanin mechanicznych na części składowe pod działaniem siły odśrodkowej. Urządzenia używane do tego celu nazywane są wirówkami. Główną częścią wirówki jest wirnik z zamontowanymi w nim gniazdami na probówki wirówkowe. Wirnik obraca się z dużą prędkością, w wyniku czego powstają znaczne siły odśrodkowe, pod wpływem których oddzielane są mieszaniny mechaniczne, na przykład osadzają się cząstki zawieszone w cieczy.

Wirówki: 1 - ręczna: 2 - z napędem elektrycznym.

W laboratoriach klinicznych i sanitarnych wirowanie służy do oddzielenia osocza krwi, od gęstych cząstek z płynnej części moczu itp. W tym celu stosuje się wirówki ręczne (ryc. 1) lub wirówki elektryczne, prędkość obrotowa które można regulować (rys. 2).

Ultrawirówki, których prędkość obrotowa wirnika przekracza 40 000 obr./min, są zwykle stosowane w praktyce doświadczalnej do oddzielania organelli komórkowych, oddzielania cząstek koloidalnych, makrocząsteczek itp.

Wirowanie to oddzielanie grubych systemów, składających się z płynnych i stałych składników o różnej gęstości, za pomocą specjalnego aparatu zwanych wirówkami. Zasada działania wirówki polega na wytworzeniu dużej siły odśrodkowej, pod wpływem której szybkość rozdzielania składników mieszaniny umieszczonej w wirówce wzrasta wielokrotnie w porównaniu do szybkości ich rozdzielania pod wpływem grawitacji.

Metoda wirowania jest szeroko stosowana w biologii, medycynie i technice, często zastępując procesy filtrowania, osadzania i prasowania.

Wirówka posiada obudowę, mechanizm napędowy, wirnik, komorę roboczą (zamykającą) oraz pulpit sterowniczy. Niektóre wirówki wyposażone są w zegar elektryczny, który zapewnia automatyczne wyłączanie i hamowanie w zakresie od 5 do 60 minut. Wirówki specjalne posiadają agregaty chłodnicze i próżniowe z urządzeniami śledzącymi i sterującymi automatycznymi. Główną częścią każdej wirówki jest wirnik (w wirówkach laboratoryjnych zwykle jest on umieszczony na pionowo zamontowanym wale silnika elektrycznego lub obracany różnymi zębatkami z wału silnika, czasem nawet ręcznie). Wirnik wirówki to tarcza (krzyż) z zawiasowymi gniazdami na metalowe tuleje, w których umieszczane są probówki, które podczas obrotu przyjmują pozycję poziomą.

Czasami wirnik jest wykonany w formie ściętego stożka z litego metalu z ogniwami na probówki (rotor kątowy); znajdujące się w nim rurki znajdują się pod stałym kątem do osi obrotu (zwykle 40°). Przy pochylonej pozycji probówek składniki mieszaniny rozdzielają się szybciej. Rozdzielanie mieszaniny odbywa się w probówkach o różnych kształtach i objętościach (rys. 1). Podczas pracy z dużymi prędkościami stosuje się probówki wykonane z polietylenu, ponieważ szklane pękają. Probówki z badanym materiałem umieszczone jedna naprzeciw drugiej w wirniku muszą być wyważone. Zapewnia to równomierne obciążenie wału wirnika i zapewnia równomierny obrót wału wirówki. Do wyważania probówek stosuje się specjalne wagi (ryc. 2).

Ryż. 1. Probówki do wirowania.

Ryż. 2. Wagi wirówkowe.

Wirówki stosowane w przemyśle różnią się od wirówek laboratoryjnych bardziej złożoną konstrukcją wirnika, która umożliwia jednoczesne wirowanie dużej ilości materiału lub prowadzenie procesów separacji w sposób ciągły.

Wirówki o małej prędkości wirnika są stosowane w medycynie do oddzielania osadów moczu, surowicy krwi od skrzepów, sedymentacji erytrocytów, w badaniach serologicznych itp.

Mikrowirówka (rys. 4) jest obsługiwana ręcznie; wyposażony w dwie wymienne dysze, z których jedna posiada gniazda na mikroprobówki i służy do określania zgodności krwi; druga - z gniazdem do wprowadzenia mikropipety z podziałką (hematokryt) - przeznaczona jest do określania procentowej zawartości komórek krwi.

Ryż. 3. Wirówka ręczna.

Ryż. 4. Mikrowirówka.

Wirówka ręczna (rys. 3) posiada cztery metalowe lub plastikowe tuleje na probówki 15 ml.

Laboratoryjna wirówka kliniczna TsLK-1 (ryc. 5, 7) ma trzy prędkości obrotowe (1000, 1500, 3000 obr/min). Rotor krzyżowy jest przystosowany do 12 konwencjonalnych probówek wirówkowych. Największa objętość odwirowanej cieczy to 150 ml.

Wirówki o dużej prędkości obrotowej są w większości przypadków wyposażone w wymienne wirniki przeznaczone do różnych objętości cieczy i służą do oddzielania drobnych zawiesin.

Laboratoryjna wirówka stołowa TsLN-2 (rys. 5, 2) posiada skośny wirnik na sześć krótkich probówek o łącznej pojemności 72 ml. Maksymalna prędkość obrotowa -9000 obr/min.

Ryż. 5. Różne wirówki laboratoryjne: 1 - kliniczne; 2 - pulpit; 3 - mały róg; 4 - stacjonarny; 5 - lodówka.

Wirówka małokątowa TsUM-1 (rys. 5, 3) posiada trzy wymienne rotory kątowe o różnej liczbie probówek i hematokrycie: rotor na 6 probówek o łącznej pojemności 150 ml, rotor na 10 probówek o łącznej pojemność 120 ml, rotor na 24 probówki o łącznej pojemności 120 ml, hematokryt na dwie kapilary. Maksymalna prędkość obrotowa to 10 000 obr./min.

Wirówka wyposażona jest w elektryczny mechanizm zegarowy.

Wirówka laboratoryjna stacjonarna TsLS-2 (rys. 5, 4) posiada dwa wymienne wirniki. Rotor krzyżowy wyposażony jest w cztery stalowe tuleje o pojemności 500 ml oraz w cztery szklane probówki o pojemności 250 ml. Wirnik kątowy dostarczany jest z 8 polietylenowymi i stalowymi probówkami o pojemności 50-75 ml. Maksymalny obrót wirników wynosi do 6000 obr/min. Wirówka wyposażona jest w elektryczny mechanizm zegarowy.

Wśród wirówek specjalnych znajduje się laboratoryjna wirówka z chłodzeniem CLR-1 (rys. 5.5), przeznaczona do wirowania w niskich temperaturach (-5 ° i wyższych) różnych substancji zmieniających się nawet w temperaturze pokojowej - głównie zawiesin białek. Wirówka posiada trzy wymienne wirniki zapewniające różne tryby wirowania. Dwa wirniki są identyczne z charakterystyką techniczną wirników wirówki typu TsLS-2, trzeci wirnik, który jest osadzony na dodatkowej osi, rozwija 18 000-18 500 obr./min. Maksymalna objętość badanego leku wynosi 48 ml. Wirówka wyposażona jest w elektryczny mechanizm zegarowy. Chłodzenie komory roboczej odbywa się za pomocą maszyny chłodniczej.

Zobacz także Ultrawirowanie.

Kurs pracy

wirowanie

1. Zasada metody

W polu odśrodkowym cząstki o różnych gęstościach, kształtach lub rozmiarach osadzają się z różnymi szybkościami. Szybkość sedymentacji zależy od przyspieszenia odśrodkowego, które jest wprost proporcjonalne do prędkości kątowej wirnika i odległości cząstki od osi obrotu:

a przyspieszenie odśrodkowe będzie wtedy

Ponieważ jeden obrót wirnika wynosi 2n radianów, prędkość kątową wirnika w obrotach na minutę można zapisać jako:

Przyspieszenie odśrodkowe jest zwykle wyrażane w jednostkach g i nazywane jest względnym przyspieszeniem odśrodkowym, tj.

Wymieniając warunki oddzielania cząstek, należy wskazać prędkość obrotową i promień wirnika oraz czas wirowania. Przyspieszenie odśrodkowe jest zwykle wyrażane w jednostkach g, obliczonych na podstawie średniego promienia obrotu kolumny cieczy w probówce wirówki. Na podstawie tego równania Dole i Kotzias opracowali nomogram wyrażający zależność GCF od prędkości i promienia wirnika r.

gdzie t to czas sedymentacji w sekundach, rj to lepkość medium, rh to promień cząstki, rf to gęstość cząstki, p to gęstość medium, hm to odległość od osi obrotu do menisku cieczy, gdzie jest odległością od osi obrotu do dna probówki.

Wirowanie preparatywne polega na wyizolowaniu materiału biologicznego do dalszych badań biochemicznych. W tym przypadku można pobrać duże ilości wyjściowego materiału biologicznego, na przykład inokulacje komórek drobnoustrojów z hodowli okresowych lub ciągłych, a także inokulacje komórek roślinnych i zwierzęcych z hodowli tkanek i osocza krwi. Za pomocą wirowania preparatywnego izoluje się dużą liczbę cząstek komórkowych w celu zbadania ich morfologii, struktury i aktywności biologicznej. Metodę stosuje się również do izolacji takich biologicznych makrocząsteczek jak DNA i białka z wcześniej oczyszczonych preparatów.

Wirowanie analityczne stosuje się głównie do badania czystych lub zasadniczo czystych preparatów makrocząsteczek lub cząstek, takich jak rybosomy. W tym przypadku stosuje się niewielką ilość materiału, a sedymentację badanych cząstek rejestruje się w sposób ciągły za pomocą specjalnych układów optycznych. Metoda pozwala na uzyskanie danych o czystości, masie cząsteczkowej i strukturze materiału. Na studiach licencjackich znacznie częściej stosuje się wirowanie preparatywne niż wirowanie analityczne, dlatego skupimy się na nim bardziej szczegółowo, chociaż obie metody opierają się na wspólnych zasadach.

2. Wirowanie preparatywne

2.1 Wirowanie różnicowe

2.2 Prędkości wirowania strefowego

Metoda zonal-speed lub, jak to się nazywa, wirowania strefowego s, polega na ułożeniu warstwy badanej próbki na powierzchni roztworu o ciągłym gradiencie gęstości. Próbka jest następnie odwirowywana, aż cząstki zostaną rozprowadzone wzdłuż gradientu w dyskretnych strefach lub pasmach. Tworząc gradient gęstości, można uniknąć mieszania się stref wynikających z konwekcji. Metoda szybkiego wirowania strefowego służy do oddzielania hybryd RNA-DNA, podjednostek rybosomów i innych składników komórkowych.

2.3 Wirowanie izopikniczne

Innym sposobem jest nałożenie próbki na powierzchnię roztworu z ciągłym gradientem gęstości obejmującym zakres gęstości wszystkich składników mieszaniny. Wirowanie prowadzi się do momentu, gdy gęstość cząstek w stanie wyporu będzie równa gęstości odpowiednich stref, tj. dopóki cząstki nie zostaną rozdzielone na strefy. Metoda ta nazywana jest strefową izopyknicą lub wirowaniem rezonansowym, ponieważ chodzi tu o gęstość wyporu, a nie o wielkość czy kształt cząstek. Na gęstość, przy której cząstki tworzą pasma izopikalne, ma wpływ charakter ośrodka zawiesiny; cząsteczki mogą być przepuszczalne dla niektórych związków w roztworze i nieprzepuszczalne dla innych lub mogą przyłączać cząsteczki roztworu. Przy użyciu rotora strefowego mitochondria, lizosomy, peroksysomy i mikrosomy są skoncentrowane w pasmach z 42%, 47%, 47% i 27% sacharozą, co odpowiada gęstości odpowiednio 1,18, 1,21, 1,21 i 1,10 g-cm -3. Gęstość organelli subkomórkowych zależy również od ich selektywnego pobierania niektórych związków. Wprowadzenie szczurom detergentu Triton WR-1339, który nie powoduje hemolizy, prowadzi do zwiększenia wielkości i zmniejszenia gęstości lizosomów wątrobowych; gęstość mitochondriów i peroksysomów pozostaje niezmieniona. Pomimo tego, że właściwości sedymentacyjne lizosomów z reguły się nie zmieniają, ich gęstość równowagowa w gradiencie sacharozy spada z 1,21 do 1,1, co prowadzi do odpowiedniego oddzielenia frakcji lizosomalno-peroksysomalnej. Cecha ta jest wykorzystywana w ilościowej separacji lizosomów, mitochondriów i peroksysomów, polegającej na usunięciu z jednorodnego ośrodka wszystkich cząstek o gęstości większej niż mikrosomów, a następnie izopikalnym wirowaniu wytrąconych ciężkich cząstek.

2.4 Równowagowe wirowanie w gradiencie gęstości

Sole metali ciężkich, takich jak rubid lub cez, a także roztwory sacharozy są wykorzystywane do tworzenia gradientu gęstości. Próbkę, taką jak DNA, miesza się ze stężonym roztworem chlorku cezu. Zarówno substancja rozpuszczona, jak i rozpuszczalnik są początkowo równomiernie rozprowadzone w całej objętości. Podczas wirowania ustala się równowagowy rozkład stężenia, a w konsekwencji gęstość CsCl, ponieważ jony cezu mają dużą masę. Pod wpływem przyspieszenia odśrodkowego cząsteczki DNA ulegają redystrybucji, gromadząc się w postaci wydzielonej strefy w części probówki o odpowiadającej im gęstości. Metoda ta jest stosowana głównie w wirowaniu analitycznym i została wykorzystana przez Meselsona i Stahla do badania mechanizmu replikacji DNA E. coli. Wirowanie w gradiencie gęstości równowagi jest również jedną z metod rozdzielania i badania lipoprotein ludzkiego osocza.

2.5Kształtowanie i wydobywanie gradientów

2.5.1 Charakter gradientów

Do tworzenia gradientów gęstości roztworów najczęściej stosuje się roztwory sacharozy, czasami o ustalonym pH. W niektórych przypadkach dobrą separację uzyskuje się stosując D2 0 zamiast zwykłej wody. 2.1 pokazuje właściwości niektórych roztworów sacharozy.

Wybór gradientu jest podyktowany konkretnymi zadaniami frakcjonowania. Na przykład ficol, produkowany przez Pharmacia FineChemicals, może zastąpić sacharozę w przypadkach, gdy konieczne jest wytworzenie gradientów o dużej gęstości i niskim ciśnieniu osmotycznym. Kolejną zaletą ficolu jest to, że nie przenika przez błony komórkowe. Sole metali ciężkich, takich jak rubid i cez, służą do tworzenia gradientów o większej gęstości, jednak ze względu na korozyjne działanie CsCl gradienty takie stosuje się tylko w wirnikach wykonanych z metali opornych, takich jak tytan.

2.5.2 Technika stopniowego gradientu gęstości

2.5.3 Technika tworzenia gładkiego gradientu gęstości

2.5.4 Ekstrakcja gradientów z probówek wirówkowych

2.5.5 Wirówki preparatywne i ich zastosowania

Wirówki preparatywne można podzielić na trzy główne grupy: wirówki ogólnego przeznaczenia, wirówki szybkoobrotowe i ultrawirówki preparatywne. Wirówki ogólnego przeznaczenia dają maksymalną prędkość 6000 obr/min i RCF do 6000 g. Różnią się od siebie jedynie pojemnością i posiadają szereg wymiennych wirników: kątowe i z wiszącymi szkłami. Jedną z cech tego typu wirówek jest ich duża pojemność – od 4 do 6 dm3, co pozwala na ładowanie ich nie tylko probówkami wirówkowymi o pojemności 10,50 i 100 cm3, ale również naczyniami o pojemności do 1,25 dm3. We wszystkich tego typu wirówkach wirniki są sztywno osadzone na wale napędowym, a probówki wraz z zawartością muszą być starannie wyważone i różnić się masą nie większą niż 0,25 g. powinny być ustawione symetrycznie względem siebie. inne, zapewniając w ten sposób równomierne rozłożenie probówek względem osi obrotu wirnika.

Szybkoobrotowe wirówki zapewniają maksymalną prędkość 25 000 obr./min-1 i RCF do 89 000 g. Komora wirnika jest wyposażona w system chłodzenia, który zapobiega nagrzewaniu się, które powstaje w wyniku tarcia podczas obrotu wirnika. Wirówki szybkoobrotowe z reguły mają pojemność 1,5 dm3 i są wyposażone w wymienne wirniki, zarówno kątowe, jak i wiszące.

Ultrawirówki preparatywne zapewniają maksymalną prędkość do 75 000 obr./min i maksymalne przyspieszenie wirowania 510 000 g. Wyposażone są zarówno w lodówkę, jak i jednostkę próżniową, aby zapobiec przegrzaniu wirnika z powodu jego tarcia z powietrzem. Wirniki takich wirówek wykonane są z wysokowytrzymałych stopów aluminium lub tytanu. Wirniki ze stopu aluminium są stosowane głównie, jednak w przypadkach, gdy wymagane są szczególnie wysokie prędkości, stosuje się wirniki tytanowe. Aby zredukować wibracje wynikające z niewyważenia wirnika spowodowanego nierównomiernym wypełnieniem probówek wirówkowych, ultrawirówki mają elastyczny wał. Probówki wirówkowe i ich zawartość należy dokładnie wyważyć z dokładnością do 0,1 g. Podobne wymagania należy przestrzegać przy ładowaniu wirników wirówek do celów ogólnych.

2.6 Konstrukcja wirników

2.6.1 Wirniki kątowe i wirniki z wiszącymi kubełkami

2.6.2 Wirniki ciągłe

Wirniki ciągłe są przeznaczone do szybkiego frakcjonowania stosunkowo małych ilości materiału stałego z zawiesin o dużej objętości, na przykład do izolacji komórek z pożywek hodowlanych. Podczas wirowania do wirnika w sposób ciągły dodawana jest zawiesina cząstek; wydajność wirnika zależy od charakteru osadzanego preparatu i waha się od 100 cm3 do 1 dm3 na minutę. Osobliwością wirnika jest to, że jest to izolowana komora o specjalnej konstrukcji; jego zawartość nie komunikuje się ze środowiskiem zewnętrznym, a zatem nie jest zanieczyszczona ani rozpylona.

2.6.3 Wirniki strefowe lub Anderson

Napełnianie wirnika odbywa się, gdy obraca się on z prędkością około 3000 obr/min-1. Wstępnie utworzony gradient jest pompowany do wirnika, zaczynając od warstwy o najmniejszej gęstości, która jest równomiernie rozłożona na obwodzie wirnika i jest utrzymywana na jego zewnętrznej ścianie prostopadle do osi obrotu dzięki sile odśrodkowej. Wraz z późniejszym dodawaniem warstw gradientu o większej gęstości następuje ciągłe przesunięcie w kierunku środka warstw o mniejszej gęstości. Po wpompowaniu całego gradientu do wirnika, jest on wypełniany do pełnej objętości roztworem zwanym „poduszką”, którego gęstość jest taka sama lub nieznacznie przekracza najwyższą gęstość wstępnie uformowanego gradientu.

Następnie przez rurkę osiową nakładana jest warstwa badanej próbki, która jest przemieszczana z rurki do objętości wirnika za pomocą roztworu o mniejszej gęstości, przy czym taką samą objętość „poduszki” usuwa się z obrzeża. Po wszystkich tych procedurach prędkość obrotową wirnika dostosowuje się do prędkości roboczej i przeprowadza się frakcjonowanie strefowe lub strefowo-izopikniczne przez wymagany okres czasu. Ekstrakcja frakcji odbywa się przy prędkości wirnika 3000 obr/min – min-1. Zawartość wirnika jest przesuwana poprzez dodanie „poduszki” z obrzeża, przede wszystkim przemieszczone są mniej gęste warstwy. Dzięki specjalnej konstrukcji osiowego kanału wirnika Andersona nie dochodzi do mieszania stref podczas ich przemieszczania. Gradient wychodzący jest przepuszczany przez urządzenie rejestrujące, na przykład celę spektrofotometru, za pomocą którego można określić zawartość białka metodą absorpcji przy 280 nm, lub przez specjalny detektor radioaktywności, po czym zbierane są frakcje.

Wydajność wirników strefowych stosowanych przy średnich prędkościach waha się od 650 do 1600 cm3, co pozwala na uzyskanie dość dużej ilości materiału. Wirniki strefowe służą do usuwania zanieczyszczeń białkowych z różnych preparatów oraz do izolowania i oczyszczania mitochondriów, lizosomów, polisomów i białek.

2.6.4 Analiza frakcji subkomórkowych

Analiza dystrybucji enzymów we frakcjonowanych tkankach opiera się na dwóch ogólnych zasadach. Pierwszym z nich jest to, że wszystkie cząstki danej populacji subkomórkowej zawierają ten sam zestaw enzymów. Drugi zakłada, że każdy enzym jest zlokalizowany w określonym miejscu w komórce. Gdyby ta pozycja była prawdziwa, enzymy mogłyby działać jako markery dla odpowiednich organelli: na przykład oksydaza cytochromowa i oksydaza monoaminowa służyłyby jako enzymy markerowe mitochondrialne, hydrolazy kwaśne jako markery lizosomów, katalaza jako marker peroksysomów, a glukoza-6- fosfataza - marker błony mikrosomalnej. Okazało się jednak, że niektóre enzymy, np. dehydrogenaza jabłczanowa, P-glukuronidaza, NADP-H-cytochrom-c-reduktaza są zlokalizowane w więcej niż jednej frakcji, dlatego dobór enzymów markerowych frakcji subkomórkowych w poszczególnych do przypadku należy podchodzić z dużą ostrożnością.Ponadto brak enzymu markerowego nie oznacza braku odpowiednich organelli.Prawdopodobne jest, że podczas frakcjonowania enzym jest tracony przez organelle lub jest hamowany lub inaktywowany, więc co najmniej dwa enzymy markerowe są zwykle określane dla każdej frakcji.

Frakcja	Objętość, cm"	Hodowla ogólna	Wykluczenie, 660 nm	Jednostki aktywności enzymu	Wydajność aktywności we frakcji, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Frakcjonowanie przez wirowanie różnicowe

2.7.1 Prezentacja wyników

2.7.2 Ultrawirowanie analityczne

W przeciwieństwie do wirowania preparatywnego, którego celem jest oddzielenie substancji i ich oczyszczenie, ultrawirowanie analityczne służy głównie do badania właściwości sedymentacyjnych makrocząsteczek biologicznych i innych struktur. Dlatego w wirowaniu analitycznym stosuje się wirniki i układy rejestrujące o specjalnej konstrukcji: pozwalają na ciągłe monitorowanie sedymentacji materiału w polu wirówki.

Ultrawirówki analityczne mogą osiągać prędkości do 70 000 obr./min, generując przyspieszenie odśrodkowe do 500 000 g. Ich wirnik z reguły ma kształt elipsoidy i jest połączony sznurkiem z silnikiem, co umożliwia zmianę prędkości obrotowej wirnika. Wirnik obraca się w komorze próżniowej wyposażonej w urządzenie chłodnicze i posiada dwie komórki analityczne i wyważające, które są zainstalowane w wirówce ściśle pionowo, równolegle do osi obrotu. Cela równoważąca służy do równoważenia celi analitycznej i jest metalowym blokiem z precyzyjnym systemem. Posiada również dwa otwory indeksowe znajdujące się w ściśle określonej odległości od osi obrotu, za pomocą których wyznaczane są odpowiednie odległości w komórce analitycznej. Komora analityczna, której pojemność wynosi zwykle 1 cm3, ma kształt sektorowy. Prawidłowo zainstalowany w wirniku, mimo że jest ustawiony w pozycji pionowej, działa na tej samej zasadzie, co wirnik z wiszącymi kubełkami, tworząc niemal idealne warunki sedymentacji. Na końcach celi analitycznej znajdują się okienka ze szkłami kwarcowymi. Ultrawirówki analityczne wyposażone są w układy optyczne, które umożliwiają monitorowanie sedymentacji cząstek podczas całego okresu wirowania. W określonych odstępach czasu osadzony materiał można fotografować. Podczas frakcjonowania białek i DNA sedymentację monitoruje się przez absorpcję w ultrafiolecie, a w przypadkach, gdy badane roztwory mają różne współczynniki załamania, przy użyciu systemu Schlierena lub systemu interferencji Rayleigha. Dwie ostatnie metody opierają się na fakcie, że gdy światło przechodzi przez przezroczysty roztwór składający się ze stref o różnych gęstościach, światło załamuje się na granicy strefy. Podczas sedymentacji powstaje granica między strefami z ciężkimi i lekkimi cząsteczkami, która działa jak soczewka refrakcyjna; w tym przypadku na kliszy fotograficznej używanej jako detektor pojawia się pik. W trakcie sedymentacji przesuwa się granica, a w konsekwencji szczyt, którego prędkość można wykorzystać do oceny szybkości sedymentacji materiału. Systemy interferometryczne są bardziej czułe niż systemy Schlierena. Ogniwa analityczne są jednosektorowe, które są używane najczęściej, oraz dwusektorowe, które są wykorzystywane do badań porównawczych rozpuszczalnika i substancji rozpuszczonej.

W biologii ultrawirowanie analityczne służy do określania mas cząsteczkowych makrocząsteczek, sprawdzania czystości uzyskanych próbek oraz badania zmian konformacyjnych w makrocząsteczkach.

2.8 Zastosowanie ultrawirowania analitycznego

2.8.1 Oznaczanie mas cząsteczkowych

Najpopularniejszą metodą jest oznaczanie masy cząsteczkowej za pomocą szybkości sedymentacji. Wirowanie odbywa się z dużymi prędkościami, dzięki czemu cząstki, początkowo równomiernie rozłożone w całej objętości, zaczynają poruszać się w porządku wzdłuż promienia od środka obrotu. Pomiędzy obszarem rozpuszczalnika, już wolnym od cząstek, a jego częścią, która je zawiera, tworzy się wyraźna granica. Granica ta porusza się podczas wirowania, co umożliwia wyznaczenie szybkości sedymentacji cząstek jedną z powyższych metod, rejestrując ten ruch na płycie fotograficznej.

Szybkość sedymentacji zależy od następującej zależności:

gdzie x to odległość od osi obrotu w cm,

t - czas w s,

w jest prędkością kątową w rad-s-1,

s jest współczynnikiem sedymentacji „cząsteczki.

Współczynnik sedymentacji to prędkość na jednostkę przyspieszenia, mierzona w jednostkach Seedberga; 1 jednostka Swedberga jest równa 10_13 s. Wartość liczbowa s zależy od masy cząsteczkowej i kształtu cząstek i jest wartością charakterystyczną dla danej cząsteczki lub struktury supramolekularnej. Na przykład współczynnik sedymentacji lizozymu wynosi 2,15 S; katalaza ma współczynnik sedymentacji 11,35S, podjednostki rybosomów bakteryjnych od 30 do 50S, a podjednostki rybosomów eukariotycznych od 40 do 60S.

gdzie M to masa cząsteczkowa cząsteczki, R to stała gazowa, T to temperatura bezwzględna, s to współczynnik sedymentacji cząsteczki, D to współczynnik dyfuzji cząsteczki, v to częściowa objętość właściwa, którą można rozpatrywany jako objętość zajmowana przez jeden gram substancji rozpuszczonej, p oznacza gęstość rozpuszczalnika.

Metoda bilansowania sedymentacji. Oznaczanie mas cząsteczkowych tą metodą odbywa się przy stosunkowo niskich prędkościach wirnika, rzędu 7000-8000 obr/min, dzięki czemu cząsteczki o dużej masie cząsteczkowej nie osiadają na dnie. Ultrawirowanie prowadzi się do momentu osiągnięcia przez cząstki równowagi, która ustala się pod działaniem sił odśrodkowych z jednej strony i sił dyfuzyjnych z drugiej, to znaczy do momentu, gdy cząstki przestaną się poruszać. Następnie, zgodnie z uzyskanym gradientem stężenia, masę cząsteczkową substancji oblicza się „zgodnie ze wzorem

gdzie R to stała gazowa, T to temperatura bezwzględna, ω to prędkość kątowa, p to gęstość rozpuszczalnika, v to częściowa objętość właściwa, cx i c2 to stężenie substancji rozpuszczonej w odległościach r i r2 od oś obrotu.

Wadą tej metody jest to, że osiągnięcie równowagi sedymentacyjnej zajmuje dużo czasu - od kilku dni do kilku tygodni przy ciągłej pracy wirówki.

Metoda dochodzenia do równowagi sedymentacyjnej została opracowana w celu pozbycia się wad poprzedniej metody, związanych z dużym nakładem czasu potrzebnego na „ustalenie równowagi. Za pomocą tej metody można określić masy cząsteczkowe, gdy odwirowany roztwór znajduje się w stan zbliżenia się do równowagi Najpierw makrocząsteczki są równomiernie rozmieszczone w całej objętości kuwety analitycznej, następnie w miarę postępu wirowania cząsteczki osadzają się, a gęstość roztworu w obszarze łąkotki stopniowo maleje. starannie rejestrowane, a następnie, za pomocą skomplikowanych obliczeń obejmujących dużą liczbę zmiennych, masę cząsteczkową danego związku określa się wzorami:

gdzie R to stała gazowa, T to temperatura bezwzględna, v to częściowa objętość właściwa, p to gęstość rozpuszczalnika, dcldr to gradient stężenia makrocząsteczki, hm i gd to odległość od menisku i dna probówka, odpowiednio, cm i sd to stężenie makrocząsteczek w menisku, a y odpowiednio na dnie probówki, Mm i MR to wartości mas cząsteczkowych wyznaczone z rozkładu stężenia substancji w menisk i dno rurki.

2.8.2 Ocena czystości preparatów

2.8.3 Badanie zmian konformacyjnych w makrocząsteczkach