Sunum Açıklama Santrifüjleme. Biyolojinin çeşitli alanlarında kullanımı. slaytlarla
Santrifüjleme. Biyolojinin çeşitli alanlarında kullanımı. Hazırlayan: Levikov, D.A.
Santrifüjleme Bu, merkezkaç kuvvetinin etkisiyle mekanik karışımların bileşenlerine ayrılmasıdır. Bu amaçla kullanılan cihazlara santrifüj denir. Santrifüjün ana kısmı, içine monte edilmiş santrifüj tüpleri için yuvalara sahip bir rotordur. Rotor, yüksek hızda döner, bunun sonucunda, mekanik karışımların ayrıldığı, örneğin bir sıvı içinde süspanse edilen partiküller birikir, etkisi altında önemli merkezkaç kuvvetleri oluşturulur.
Bir santrifüjde meydana gelen işlemler Aşağıdaki işlemler santrifüjlere ayrılır: 1) Santrifüjlü filtrasyon. 2) Santrifüjlü çökeltme. 3) Santrifüj arıtma.
Santrifüj Filtrasyon Santrifüj filtreleme, delikli hazneli santrifüjlerdeki süspansiyonları ayırmak için bir işlemdir. Böyle bir tamburun iç yüzeyi bir filtre bezi ile kaplanmıştır. Süspansiyon merkezkaç kuvveti ile tamburun duvarlarına atılırken, katı faz kumaşın yüzeyinde kalır ve sıvı merkezkaç kuvvetinin etkisi altında tortu tabakasından geçer ve kumaş deliklerden dışarı doğru çıkarılır. davul. Santrifüj filtrasyon genellikle birbirini takip eden üç fiziksel süreçten oluşur: 1) tortu oluşumu ile filtrasyon; 2) tortu sıkışması; 3) moleküler kuvvetler tarafından tutulan sıvının tortusundan çıkarılması;
Santrifüjle Çökeltme Santrifüjle çöktürme, masif duvarlı tamburlu santrifüjlerdeki süspansiyonların ayrılması işlemidir. Süspansiyon, tamburun alt kısmına sokulur ve merkezkaç kuvvetinin etkisi altında duvarlara atılır. Duvarlarda bir tortu tabakası oluşur ve sıvı bir iç tabaka oluşturur ve ayırmaya giren süspansiyon tarafından tamburdan yer değiştirir. Aynı zamanda sıvı yükselir, tamburun kenarından taşar ve dışarı çıkarılır. Bu durumda, iki fiziksel süreç gerçekleşir: 1) Katı fazın birikmesi. 2) Tortu sıkıştırma.
Santrifüj arıtma Santrifüj arıtma, ince süspansiyonları ve kolloidal çözeltileri ayırmak için bir işlemdir. Ayrıca katı variller içinde gerçekleştirilir. Fiziksel özüne göre, merkezkaç arıtma, katı parçacıkların merkezkaç kuvvetleri alanında serbest çökeltme işlemidir. Katı duvarlı tamburlarda emülsiyonların ayrılması da gerçekleştirilir. Merkezkaç kuvvetinin etkisi altında, yoğunluğa göre emülsiyonun bileşenleri, sınırlandırılmış katmanlar şeklinde düzenlenir: daha yoğun bir sıvının dış tabakası ve daha hafif bir sıvının iç tabakası. Sıvılar tamburdan ayrı olarak boşaltılır.
Klinik ve sıhhi laboratuvarlarda, kırmızı kan hücrelerini kan plazmasından, kan pıhtılarını serumdan, katı partikülleri idrarın sıvı kısmından vb. ayırmak için santrifüj kullanılır. Bu amaçla manuel santrifüjler veya elektrikli santrifüjler kullanılır, dönme hızı hangisi ayarlanabilir. Rotor hızı 40.000 rpm'yi aşan ultrasantrifüjler, deneysel uygulamada genellikle hücre organellerini ayırmak, koloidal partikülleri, makromolekülleri ve polimerleri ayırmak için kullanılır.
Sitolojide santrifüj yöntemi Diferansiyel santrifüj yöntemi, hücrelerin fraksiyonlanması, yani çeşitli organellerin ve hücre kapanımlarının özgül ağırlığına bağlı olarak içeriklerinin fraksiyonlara ayrılması için kullanılır. Bunu yapmak için, ince öğütülmüş hücreler özel bir aparatta - bir ultrasantrifüjde döndürülür. Santrifüjlemenin bir sonucu olarak, hücre bileşenleri, yoğunluklarına göre kendilerini düzenleyerek çözeltiden çökelirler. Yoğun yapılar daha düşük santrifüj hızlarında yerleşirken, daha az yoğun yapılar yüksek santrifüjleme hızlarında yerleşir. Ortaya çıkan katmanlar ayrılır ve ayrı ayrı incelenir.
Bitki botanik ve fizyolojisinde santrifüjleme Santrifüjleme, hücre altı parçacıkların çeşitli fraksiyonlarını elde etmeyi ve her fraksiyonun özelliklerini ve işlevlerini ayrı ayrı incelemeyi mümkün kılar. Örneğin, kloroplastlar ıspanak yapraklarından izole edilebilir, uygun bir ortamda tekrarlanan santrifüjleme ile hücre parçalarından yıkanabilir ve çeşitli deneysel koşullar altındaki davranışları incelenebilir veya kimyasal bileşimleri belirlenebilir. Ayrıca, tekniğin çeşitli modifikasyonlarını kullanarak, bu plastidleri yok etmek ve farklı santrifüjleme (farklı hızlanma değerlerinde partiküllerin tekrarlanan çökeltilmesi) yoluyla kurucu elemanlarını izole etmek mümkündür. Bu şekilde, plastidlerin çok düzenli bir yapı ile ayırt edilen yapılar içerdiğini göstermek mümkün oldu - sözde grana; tüm granalar kloroplast sınırlayıcı zar (kloroplast zarfı) içindedir. Bu yöntemin avantajları, kişinin daha büyük hücre altı parçacıkların parçası olan işlevsel alt birimlerin varlığını ortaya çıkarmasına izin verdiği için basitçe paha biçilmezdir; özellikle, diferansiyel santrifüj yöntemi kullanılarak, grana'nın kloroplastın ana yapısal elemanı olduğunu göstermek mümkün oldu.
Virolojide santrifüjleme yöntemi Bracke yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yöntemi, bitki virüslerinin hem izolasyonu hem de nicel karakterizasyonu için kullanılabilir. Görünüşe göre, bu yöntem birçok olasılık ile doludur ve şu anda viroloji ve moleküler biyoloji alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Yoğunluk gradyanında santrifüjleme ile çalışmalar yapılırken, santrifüj tüpü kısmen yoğunluğu alttan menisküse doğru azalan bir çözelti ile doldurulur. Sükroz çoğunlukla bitki virüslerinin fraksiyonasyonunda bir gradyan oluşturmak için kullanılır. Santrifüjlemeye başlamadan önce, virüs partikülleri ya solüsyon boyunca dağıtılabilir ya da gradyanın tepesine uygulanabilir. Brakke, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için üç farklı teknik önerdi. İzopepik (denge) santrifüjlemede, gradyandaki tüm parçacıklar, ortamın yoğunluğunun kendi yoğunluklarına eşit olduğu bir seviyeye ulaşana kadar süreç devam eder. Böylece, parçacıkların fraksiyonasyonu bu durumda yoğunluklarındaki farklılıklara göre gerçekleşir. Sükroz çözeltileri, birçok virüsün izopikal ayrımı için yeterli yoğunluğa sahip değildir. Yüksek hızlı bölgesel santrifüjlemede, virüs önce önceden oluşturulmuş bir gradyana uygulanır. Her türden parçacıklar, büyüklüklerine, şekillerine ve yoğunluklarına bağlı olarak bir zon veya bant şeklinde bir gradyan boyunca çökerken. Santrifüjleme, parçacıklar hala çökelmeye devam ederken sonlandırılır. Denge bölgeli santrifüjleme, yüksek hızlı bölgesel santrifüjlemeye benzer, ancak bu durumda, bir izopiknal duruma ulaşılana kadar santrifüjleme devam eder. Yüksek hızlı santrifüjlemede yoğunluk gradyanının rolü, konveksiyonu önlemek ve belirli bölgelerde farklı tipteki molekülleri sabitlemektir. Yoğunluk gradyanlı santrifüjlemenin arkasındaki teori karmaşıktır ve iyi anlaşılmamıştır. Uygulamada bu, bitki virüsleriyle çalışırken yaygın olarak kullanılan basit ve zarif bir yöntemdir.
Santrifüjleme yöntemini kullanmadaki zorluklar Diferansiyel santrifüjleme yönteminin kullanımı birçok metodolojik zorlukla ilişkilidir. Birincisi, parçacıklar izole edildiğinde yapıları zarar görebilir. Bu nedenle, hücre içi fraksiyonların yapısına zarar vermeyecek özel hücre imha yöntemlerinin geliştirilmesi gerekiyordu. İkincisi, hücre altı parçacıkların zarları olduğundan, serbest bırakılmaları sırasında çeşitli ozmotik etkiler meydana gelebilir. Sonuç olarak, incelenen nesnelerin üst yapısının, izolasyonları sırasında bile yok edilmemesi için, hücrelerin yok edildiği ve parçacıkların çökeldiği ortamın bileşiminin dikkatlice seçilmesi gerekir. Ve son olarak, hücre altı parçacıkların yıkanması (ortamda yeniden süspansiyonları ve ardından tekrarlanan santrifüjleme), içlerinde bulunan ve difüzyon kuvvetlerinin etkisi altında çözeltiye geçen bazı maddelerin kaybına yol açabilir. Bu bağlamda, hangi küçük moleküllerin incelenen yapıların gerçekten elementleri olduğunu ve hangilerinin izolasyon sürecinde yüzeyleri tarafından basitçe adsorbe edildiğini anlamak bazen zordur. Bu durum, seçilen nesnelerin bazı işlevsel özelliklerinin doğru bir şekilde belirlenmesini zorlaştırmaktadır.
Santrifüjleme Bu, mekanik karışımların bileşenlerine ayrılmasıdır.
merkezkaç kuvvetinin etkisiyle. Bunun için kullanılan aletler
hedeflere santrifüj denir.
Santrifüjün ana kısmı, içine monte edilmiş bir rotordur.
santrifüj tüpleri için yuva yapar. Rotor ile döner
önemli ölçüde sonuçlanan yüksek hız
etkisi altında olan merkezkaç kuvvetinin büyüklüğü
örneğin mekanik karışımlar ayrılır
sıvı içinde asılı parçacıkların tortulaşması.
Santrifüjde gerçekleşen işlemler
Santrifüjler aşağıdaki süreçleri paylaşır:1) Santrifüj filtrasyon.
2) Santrifüjlü çökeltme.
3) Santrifüj arıtma.
santrifüj filtrasyon
Santrifüj filtrasyonile santrifüjlerdeki süspansiyonları ayırma işlemi
delikli davullar. İç yüzey
Böyle bir tamburun üzeri bir filtre bezi ile kaplanmıştır.
Süspansiyon, merkezkaç kuvveti ile fırlatılır.
tambur duvarları, katı faz açık kalırken
doku yüzeyi ve eylem altındaki sıvı
merkezkaç kuvveti tortu tabakasından geçer ve
kumaş, tamburdaki deliklerden dışarıya çıkarılır.
Santrifüj filtrasyon genellikle şunlardan oluşur:
ardışık üç fiziksel süreç:
1) bir çökelti oluşumu ile süzme;
2) tortu sıkışması;
3) tutulan sıvının tortusundan çıkarılması
moleküler kuvvetler;
merkezkaç çökeltme
merkezkaç çökeltmeSantrifüj çökeltme - ayırma işlemi
tamburlu santrifüjlerdeki süspansiyonlar
sağlam duvarlar. Süspansiyon alt kısma enjekte edilir.
tamburun bir parçası ve merkezkaç kuvvetinin etkisi altında
duvarlara atıldı. Duvarlar bir katman oluşturur
tortu ve sıvı iç tabakayı oluşturur ve
ayırmaya giren tamburdan yerinden
süspansiyon. sıvı yükselir
tamburun kenarına dökülür ve çıkarılır
dışarı.
Bu durumda, iki fiziksel süreç gerçekleşir:
1) Katı fazın birikmesi.
2) Tortu sıkıştırma.
santrifüj arıtma
Santrifüj arıtma - ayırma işlemiince süspansiyonlar ve kolloidal çözeltiler. Yani
aynısı katı variller içinde gerçekleştirilir.
Fiziksel olarak, merkezkaç
açıklama bir süreçtir
alanda katı parçacıkların serbest birikimi
merkezkaç kuvvetleri.
Sağlam duvarlı varillerde
emülsiyonların ayrılması da gerçekleştirilir. Altında
merkezkaç kuvveti bileşenlerinin etkisi
yoğunluğa göre emülsiyonlar
sınırlandırılmış katmanlar şeklinde bulunur:
daha yüksek yoğunluğa sahip bir sıvının dış tabakası
ve daha hafif bir sıvının bir iç tabakası.
Sıvılar tamburdan ayrı olarak boşaltılır. Klinik ve sıhhi laboratuvarlarda
santrifüj kullanımı
eritrositleri ayırmak için
kan plazması, kan pıhtıları
serum, yoğun parçacıklar
idrarın sıvı kısmı vb.
bu amaçla veya
manuel santrifüjler veya
elektrikli santrifüjler,
kimin dönüş hızı
ayarlanabilir.
Ultrasantrifüjler, hız
rotorların dönüşü
40.000 rpm'yi aşıyor,
genellikle kullanılır
deneysel uygulama
organelleri ayırmak
hücreler, kolloidal ayırma
parçacıklar, makromoleküller,
polimerler.
Parazitolojide santrifüj kullanımı
Yöntem karmaşık ayırt etmek için kullanılırkan karışımı, idrar veya dışkı, ardından
helmintlerin ondan daha fazla izolasyonu
mikroskop altında inceleme ve materyalin fiksasyonu. AT
numunede mevcut santrifüj işlemi
parazitler filtreden geçer ve içinde birikir
tüpün alt konik bölmesi. Filtre Mesh
özel boyutlandırılmış hücrelerle
bir test tüpünde dikey olarak bulunur, sonuç olarak
yatay (yanal) ne olur
numune filtrasyonu. Sonuç olarak, kaba
sindirilmemiş gıda parçacıkları, lif
karıştırma odası ve parazitler ve yumurtaları
filtreden serbestçe geçirin. Yani
Böylece parazitler,
ince tortunun yüzey tabakası ve
laboratuvar doktoru sadece dikkatli bir şekilde seçebilir
ile mikroskopi için örnek
otomatik pipet ve uygulayın
kayma.
Sitolojide santrifüj yöntemi
diferansiyel yöntemsantrifüj için kullanılır
hücrelerin fraksiyonasyonu, yani tabakalaşmaları
içeriği, belirli özelliklere bağlı olarak kesirlere
çeşitli organellerin ve hücresel kapanımların ağırlığı.
Bunu yapmak için, ince bölünmüş hücreler döndürülür.
özel aparat - ultrasantrifüj. AT
Santrifüjleme sonucunda hücre bileşenleri
çözeltiden çökelmek, yerleşmek
yoğunluğuna göre. Daha yoğun
yapılar daha düşük hızlarda biriktirilir
santrifüjleme ve daha az yoğun - yüksek
hızlar. Ortaya çıkan katmanlar ayrılır ve incelenir
ayrı ayrı.
10. Botanik ve bitki fizyolojisinde santrifüjleme
Santrifüj, çeşitli elde etmeyi mümkün kılarhücre altı parçacıkların fraksiyonları ve keşfetmek
her fraksiyonun özellikleri ve işlevleri
ayrı ayrı. Örneğin, ıspanak yapraklarından yapabilirsiniz.
kloroplastları izole edin, onları yıkayın
uygun şekilde yeniden santrifüj
hücre parçalarından besiyeri ve bunları inceleyin
çeşitli deneylerde davranış
koşulları veya kimyasal bileşimlerini belirler.
Ayrıca, çeşitli modifikasyonlar uygulayarak mümkündür
teknikleri, bu plastidleri yok edin ve izole edin
vasıtasıyla
diferansiyel santrifüjleme (tekrar tekrar
farklı değerlerde partikül birikimi
ivme) kurucu unsurları. Yani
plastidlerin içerdiğini göstermek mümkün oldu
son derece düzenli yapılar
yapı, - sözde tahıllar; tüm tahıllar
sınırlayıcı kloroplastın içindedir
zarlar (kloroplastın zarı). Avantajlar
bu yöntem çok değerli çünkü
varlığını ortaya çıkarır
oluşturan fonksiyonel alt birimler
daha büyük hücre altı parçacıklar; özellikle,
yöntemi kullanmak
11. Virolojide santrifüj yöntemi
Brakke yoğunluk gradyanlı santrifüj yöntemi,hem seçim hem de satın alma için kullanılabilir
bitki virüslerinin kantitatif özellikleri. Anlaşıldığı üzere,
Bu yöntem birçok olasılık ile doludur ve şu anda
viroloji ve moleküler alanda yaygın olarak kullanılan
Biyoloji. Yöntemle araştırma yaparken
yoğunluk santrifüjleme santrifüj tüpü
yoğunluğu azalan bir çözelti ile kısmen doldurulmuş
alttan menisküse doğru yön. Gradyan oluşturmak için
bitki virüslerinin fraksiyonasyonu en sık kullanılır
sakaroz. Santrifüjlemeye başlamadan önce virüs parçacıkları
ya çözeltinin hacmi boyunca dağıtılabilir ya da
gradyanın üst kısmı. Brakke üç farklı yöntem önerdi
yoğunluk gradyan santrifüjü. izopipik olarak
(denge) santrifüj işlemi şu ana kadar devam eder.
gradyandaki tüm parçacıklar yoğunluğun olduğu bir seviyeye ulaşana kadar
ortam kendi yoğunluğuna eşittir. Böylece,
parçacıkların fraksiyonasyonu bu durumda aşağıdakilere göre gerçekleşir:
yoğunluklarındaki farklılıklar. Sükroz çözeltileri yoktur
birçoğunun izopikal olarak ayrılması için yeterli yoğunluk
virüsler. Yüksek hızlı bölgesel santrifüjleme ile virüs
önce önceden oluşturulmuş degradeye uygulanır. parçacıklar
Her tip tortunun aynı anda bir bölge şeklinde bir gradyan yoluyla,
veya şeritler, boyutlarına, şekillerine ve boyutlarına bağlı olarak bir hızda
yoğunluk. Parçacıklar oluştuğunda santrifüjleme sonlandırılır.
hala çökelmeye devam ediyor. denge bölgesi
hız bölgesine benzer santrifüjleme
santrifüjleme, ancak bu durumda santrifüjleme
12. Santrifüj yönteminin kullanılmasındaki zorluklar
Diferansiyel santrifüj yönteminin uygulanmasıbirçok metodolojik zorlukla doludur. İlk olarak,
parçacıkların salınması yapılarına zarar verebilir. Bu yüzden
hücrelerin yok edilmesi için özel yöntemler geliştirmek gerekiyordu,
hücre altı yapısına zarar vermez.
kesirler. İkincisi, hücre altı parçacıkların
membranlar, serbest bırakılma sürecinde,
çeşitli ozmotik etkiler. Bu nedenle, bunun için
böylece incelenen nesnelerin üst yapısı tahrip olmaz
izole edildiklerinde bile, kompozisyonu dikkatlice seçmek gerekir.
hücrelerin yıkımının ve birikiminin olduğu ortam
parçacıklar. Ve son olarak, hücre altı parçacıkların yıkanması
(ortamda yeniden süspanse etmek ve sonra yeniden
santrifüjleme) bazılarının kaybına neden olabilir.
difüzyon kuvvetlerinin etkisi altında içlerinde bulunan maddeler
çözüme geç.
Bu bağlamda, küçük moleküllerden hangisinin olduğunu anlamak bazen zordur.
gerçekten de incelenen yapıların unsurlarıdır ve
izolasyon işlemi sırasında yüzeylerine basitçe adsorbe edildi.
Bu durum bazılarını tespit etmeyi zorlaştırıyor.
seçilen nesnelerin işlevsel özellikleri.
ders çalışması
santrifüj
1. Yöntem ilkesi
Maddelerin santrifüjleme ile ayrılması, bir santrifüj alanındaki parçacıkların farklı davranışlarına dayanır. Bir test tüpüne yerleştirilen parçacıkların süspansiyonu, santrifüj tahrik miline monte edilmiş bir rotora yüklenir.
Bir merkezkaç alanında, farklı yoğunluklara, şekillere veya boyutlara sahip parçacıklar farklı oranlarda biriktirilir. Sedimantasyon hızı şunlara bağlıdır:merkezkaç ivmesi, rotorun açısal hızı ve parçacık ile dönme ekseni arasındaki mesafe ile doğru orantılı:
ve merkezkaç ivmesi daha sonra olacak
Rotorun bir devri olduğundan2p radyan, rotorun dakikadaki devir cinsinden açısal hızı şu şekilde yazılabilir:
Merkezkaç ivmesi genellikle birimlerle ifade edilirg ve aradıbağıl merkezkaç ivmesi , yani
veya
Parçacıkları ayırma koşullarını listelerken, rotorun dönüş hızını ve yarıçapını ve ayrıca santrifüjleme süresini belirtin. Merkezkaç ivmesi genellikle birimlerle ifade edilirg , sıvı kolonunun ortalama dönüş yarıçapından hesaplanıriçindeSantrifüj tüpü. Denklemi temel alarak, Dole ve Kotzias, GCF'nin rotor hızına ve r yarıçapına bağımlılığını ifade eden bir nomogram derlediler.
Pirinç. 2 .1. Merkezkaç ivmesini hesaplamak için nomogram.
O'yu belirlemek için, yarıçapın değerleri ve rotorun aşırı ölçeklerdeki dönüş hızı düz bir çizgi ile bağlanır; bu düz çizginin ortalama ölçekle kesiştiği nokta, istenen merkezkaç ivmesi değerini verir. Ölçek numaralarının sağ sütununun akılda tutulması gerekir. Ö rotor hız ölçeğinin sağ sütununa karşılık gelir; sol sol.
Küresel parçacıkların çökelme hızı, yalnızca merkezkaç ivmesine değil, aynı zamanda parçacıkların yoğunluğuna ve yarıçapına ve süspansiyon ortamının viskozitesine de bağlıdır. Sıvı bir ortamdaki küresel bir parçacığın sıvı menisküsten santrifüj tüpünün dibine kadar çökelmesi için gereken süre, çökelme hızı ile ters orantılıdır ve aşağıdaki denklem ile belirlenir:
neredet - saniye cinsinden sedimantasyon süresi,rj- ortamın viskozitesi,Gh- parçacık yarıçapı, rh- parçacık yoğunluğu, p - orta yoğunluk, gm- dönüş ekseninden sıvının menisküsüne olan mesafe, gd- dönme ekseninden borunun dibine kadar olan mesafe.
Denklemden aşağıdaki gibi, belirli bir rotor hızında, homojen küresel parçacıkların tortulaşması için gereken süre, yarıçaplarının karesi ve parçacık ve ortam yoğunluklarındaki fark ile ters orantılıdır ve ortamın viskozitesi ile doğru orantılıdır. . Bu nedenle, yoğunluk ve boyut olarak farklılık gösteren heterojen, yaklaşık olarak küresel parçacıkların bir karışımı, belirli bir ivmede tüpün dibine yerleşmelerinin farklı zamanları nedeniyle veya çöken parçacıkların tüp boyunca dağılımı nedeniyle ayrılabilir. belirli bir süre sonra kurulan. Maddeleri ayırırken, ortamın yoğunluğu ve viskozitesi gibi önemli faktörleri hesaba katmak gerekir. Tarif edilen yöntemler, hücre organellerini doku homojenatlarından ayırabilir. Hücrenin ana bileşenleri şu sırayla biriktirilir: önce tüm hücreler ve bunların parçaları, ardından çekirdekler, kloroplastlar, mitokondri, lizozomlar, mikrozomlar ve son olarak ribozomlar. Küresel olmayan parçacıkların çökmesi denkleme uymaz, bu nedenle aynı kütleye sahip ancak farklı şekillerdeki parçacıklar farklı hızlarda biriktirilir. Bu özellik, makromoleküllerin konformasyonunun ultrasantrifüjünün kullanıldığı çalışmada kullanılmıştır.
sonraki biyokimyasal çalışmalar için biyolojik materyalin tahsisinden oluşur. Bu durumda, örneğin kesikli veya sürekli kültürlerden mikrobiyal hücrelerin aşılanmasının yanı sıra doku ve kan plazma kültürlerinden bitki ve hayvan hücrelerinin aşılanması gibi büyük miktarlarda başlangıç biyolojik materyali alınabilir. Hazırlayıcı santrifüjleme yardımıyla, morfolojilerini, yapılarını ve biyolojik aktivitelerini incelemek için çok sayıda hücre parçacığı izole edilir. Yöntem aynı zamanda DNA ve proteinler gibi biyolojik makromolekülleri önceden saflaştırılmış preparasyonlardan izole etmek için de kullanılır.
Analitik santrifüj Esas olarak, ribozomlar gibi makromoleküllerin veya parçacıkların saf veya pratik olarak saf preparatlarını incelemek için kullanılır. Bu durumda, az miktarda malzeme kullanılır ve çalışılan parçacıkların çökelmesi, özel optik sistemler kullanılarak sürekli olarak kaydedilir. Yöntem, malzemenin saflığı, moleküler ağırlığı ve yapısı hakkında veri elde edilmesini sağlar. Lisans atölyelerinde, hazırlıklı santrifüjleme, analitik santrifüjlemeye göre çok daha sık kullanılır, bu nedenle her iki yöntem de ortak ilkelere dayanmasına rağmen, buna daha ayrıntılı olarak odaklanacağız.
2. hazırlık santrifüjü
2 .1 Diferansiyel santrifüjleme
Bu yöntem, boyut ve yoğunluk olarak birbirinden farklı olan parçacıkların sedimantasyon hızlarındaki farklılıklara dayanmaktadır. Ayrıştırılacak malzeme, örneğin bir doku homojenatı, santrifüj ivmesinde kademeli bir artışla santrifüjlenir; bu, her aşamada tüpün tabanında belirli bir fraksiyon bırakılacak şekilde seçilir. Her adımın sonunda, çökelti süpernatandan ayrılır ve sonunda saf çökeltilmiş bir fraksiyon elde etmek için birkaç kez yıkanır. Ne yazık ki, tamamen saf bir çökelti elde etmek pratikte imkansızdır; Bunun neden olduğunu anlamak için, her santrifüjleme adımının başlangıcında santrifüj tüpünde meydana gelen sürece dönelim.
İlk olarak, homojenatın tüm parçacıkları santrifüj tüpünün hacmi üzerinde eşit olarak dağıtılır, bu nedenle bir santrifüjleme döngüsünde en ağır parçacıkların çökeltilerinin saf hazırlıklarını elde etmek imkansızdır: oluşan ilk çökelti esas olarak en ağır parçacıkları içerir, ancak, ayrıca, tüm ilk bileşenlerin belirli bir miktarı. Ağır parçacıkların yeterince saf bir şekilde hazırlanması, yalnızca ilk çökeltinin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ve santrifüjlenmesiyle elde edilebilir. Süpernatantın daha fazla santrifüjlenmesi ve ardından santrifüj ivmesinde bir artış, orta büyüklükte ve yoğunluktaki parçacıkların tortulaşmasına ve ardından en düşük yoğunluğa sahip en küçük parçacıkların tortulaşmasına yol açar. Şek. 2.3, bir sıçan karaciğer homojenatının fraksiyonlanmasının bir diyagramıdır.
Pirinç. 2.2. Bir santrifüj alanında partikül süspansiyonunun diferansiyel santrifüjü.
İlk olarak, parçacıklar santrifüj tüpünün hacmi boyunca eşit olarak dağıtılır. (a): santrifüj sırasında partiküller büyüklüklerine ve şekillerine göre çökelirler (b - e).
Pirinç. 2.3. Sıçan karaciğer homojenatının hücre altı fraksiyonlarına ayrılma şeması.
Diferansiyel santrifüjleme, hücre organellerini doku homojenatlarından izole etmek için en yaygın yöntem gibi görünmektedir. Bu yöntem, büyüklük ve yoğunluk bakımından birbirinden önemli ölçüde farklı olan bu tür hücre organellerini ayırmak için en başarılı şekilde kullanılır. Ancak bu durumda bile, elde edilen fraksiyonlar hiçbir zaman tam olarak homojen değildir ve bunların daha fazla ayrılması için aşağıda açıklanan diğer yöntemler kullanılır. Organel yoğunluğundaki farklılıklara dayanan bu yöntemler, sürekli veya kademeli yoğunluk gradyanına sahip çözeltilerde santrifüj yaparak daha verimli ayırma sağlar. Bu yöntemlerin dezavantajı, çözeltinin yoğunluk gradyanını elde etmenin zaman almasıdır.
2.2 Bölge hız santrifüjü
Bölge-hız yöntemi veya aynı zamanda adlandırıldığı gibi,s-bölgesel santrifüjleme, sürekli bir yoğunluk gradyanı ile çözeltinin yüzeyinde test numunesinin katmanlanmasından oluşur. Numune daha sonra parçacıklar ayrı bölgeler veya bantlarda gradyan boyunca dağılana kadar santrifüjlenir. Bir yoğunluk gradyanı oluşturarak, konveksiyondan kaynaklanan bölgelerin karışmasını önlemek mümkündür. Hız bölgeli santrifüj yöntemi, RNA-DNA hibritlerini, ribozom alt birimlerini ve diğer hücresel bileşenleri ayırmak için kullanılır.
Pirinç. 2 .4. Bir yoğunluk gradyanında parçacıkların hızı ve izopikal ayrımı. Santrifüjlemeye başlamadan önce partikül süspansiyonu, sıvı yoğunluk gradyanı üzerine katmanlanır. (a). Yüksek hızlı santrifüjleme ile parçacıklar izopiknal noktaya ulaşmaz ve izopiknik ayırma ile, incelenen parçacıklar karşılık gelen yoğunluğa sahip bölgeye ulaşmayana kadar santrifüjleme devam eder. (b).
2.3 izopiknik santrifüj
İzopiknik santrifüj, hem yoğunluk gradyanında hem de olağan şekilde gerçekleştirilir. Santrifüjleme bir yoğunluk gradyanında gerçekleştirilmezse, hazırlık önce santrifüjlenir, böylece moleküler ağırlığı incelenen partiküllerinkinden daha büyük olan partiküller çöker. Bu ağır partiküller atılır ve numune, yoğunluğu izole edilecek fraksiyonunkiyle aynı olan bir ortam içinde süspanse edilir ve daha sonra incelenen partiküller tüpün dibine çökene ve daha düşük yoğunluklu partiküller tüpe yüzene kadar santrifüjlenir. sıvının yüzeyi...
Pirinç. 2.5. Yoğunluk gradyanı olmadan izopikal ayırma.
Santrifüjden önce, parçacıklar santrifüj tüpünün hacmi boyunca eşit olarak dağıtılır. (a). Santrifüjden sonra, daha hafif parçacıklar üste doğru yüzerken, ağır parçacıklar tüpün altına yerleşir. (b)
Diğer bir yol, numuneyi, karışımın tüm bileşenlerinin yoğunluk aralığını kapsayan sürekli bir yoğunluk gradyanı ile çözeltinin yüzeyi üzerine katmanlamaktır. Santrifüjleme, partiküllerin kaldırma yoğunluğu karşılık gelen bölgelerin yoğunluğuna eşit olana kadar, yani partiküller bölgelere ayrılana kadar gerçekleştirilir. Yöntem, bölgesel izopiknik veya rezonant santrifüj olarak adlandırılır, çünkü buradaki ana nokta, parçacıkların boyutu veya şekli değil, kaldırma yoğunluğudur. Partiküllerin izopiknal bantlar oluşturduğu yoğunluk miktarı, süspansiyon ortamının doğasından etkilenir; parçacıklar çözeltideki bazı bileşiklere karşı geçirgenken, diğerlerine karşı geçirimsiz olabilir veya çözelti moleküllerini bağlayabilirler. Bölgesel rotor kullanıldığında, mitokondri, lizozomlar, peroksizomlar ve mikrozomlar, 1.18, 1.21, 1.21 ve 1.10 g-cm yoğunluğa karşılık gelen %42, %47, %47 ve %27 sakarozlu bantlarda konsantre edilir.-3 sırasıyla. Hücre altı organellerin yoğunluğu ayrıca belirli bileşiklerin seçici alımına da bağlıdır. Hemolitik olmayan deterjan Triton'un farelerine girişWR-1339, karaciğer lizozomlarının boyutunda bir artışa ve yoğunluğunda bir azalmaya yol açar; mitokondri ve peroksizomların yoğunluğu değişmeden kalır. Lizozomların sedimantasyon özelliklerinin bir kural olarak değişmemesine rağmen, sakaroz gradyanındaki denge yoğunlukları 1.21'den 1.1'e düşer, bu da lizozomal-peroksizomal fraksiyonun karşılık gelen bir ayrılmasına yol açar. Bu özellik, mikrozomlardan daha büyük bir yoğunluğa sahip tüm parçacıkların homojen bir ortamdan çıkarılmasına ve ardından çökeltilmiş ağır parçacıkların izopiknal santrifüjlenmesine dayalı olarak lizozomların, mitokondrilerin ve peroksizomların nicel olarak ayrılmasında kullanılır.
2.4 Denge yoğunluğu gradyan santrifüjü
Bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için rubidyum veya sezyum gibi ağır metal tuzlarının yanı sıra sakaroz çözeltileri kullanılır. DNA gibi bir numune, konsantre bir sezyum klorür çözeltisi ile karıştırılır. Hem çözünen hem de çözücü başlangıçta hacim boyunca eşit olarak dağıtılır. Santrifüjleme sırasında, bir denge konsantrasyonu dağılımı ve dolayısıyla yoğunluk kurulur.CsClsezyum iyonları büyük bir kütleye sahip olduğundan. Santrifüj ivmesinin etkisi altında, DNA molekülleri yeniden dağıtılır ve bunlara karşılık gelen yoğunluğa sahip test tüpünün bir bölümünde ayrı bir bölge şeklinde toplanır. Yöntem esas olarak analitik santrifüjlemede kullanılır ve Meselson ve Stahl tarafından DNA replikasyonu mekanizmasını incelemek için kullanılmıştır.E. koli . Denge yoğunluğu gradyanlı santrifüjleme aynı zamanda insan plazma lipoproteinlerini ayırma ve inceleme yöntemlerinden biridir.
2. 5 Gradyanları şekillendirme ve ayıklama
2.5.1 Gradyanların doğası
Çözeltilerin yoğunluk gradyanlarını oluşturmak için, çoğunlukla, bazen sabit bir pH ile sakaroz çözeltileri kullanılır. Bazı durumlarda, normal su yerine kullanıldığında iyi bir ayırma elde edilir.D2 0. Tabloda. 2.1 bazı sakaroz çözeltilerinin özelliklerini gösterir.
Konsantrasyon, %
Sükroz çözeltilerinin özellikleri
Gradyanın seçimi, belirli fraksiyonlama görevleri tarafından belirlenir. Yani örneğin fikol, şirketin ürettiğieczane İyi kimyasallar, yüksek yoğunluklu ve düşük ozmotik basınca sahip gradyanlar oluşturmanın gerekli olduğu durumlarda sakarozun yerini alabilir. Ficol'ün bir diğer avantajı da hücre zarlarından geçmemesidir. Rubidyum ve sezyum gibi ağır metal tuzları, aşındırıcı etki nedeniyle daha yüksek yoğunluklu gradyanlar oluşturmak için kullanılır.CsClbu tür gradyanlar yalnızca titanyum gibi dirençli metallerden yapılmış rotorlarda kullanılır.
2.5.2 Adım Yoğunluğu Gradyan Tekniği
Bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için, art arda azalan yoğunluğa sahip birkaç çözelti, bir pipet kullanılarak bir santrifüj tüpüne dikkatlice verilir. Daha sonra, en düşük yoğunluğa sahip olan en üst katmanda, numune dar bir bölge şeklinde katmanlanır ve ardından tüp santrifüjlenir. Çözeltinin uzun süre bekletilmesi sırasında adım adım gradyanların yumuşatılmasıyla düzgün doğrusal gradyanlar elde edilebilir. Tüpün içeriği bir tel ile hafifçe karıştırılarak veya tüp hafifçe çalkalanarak işlem hızlandırılabilir.
2.5.3 Düzgün yoğunluk gradyanı oluşturma tekniği
Çoğu durumda, düzgün bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için özel bir cihaz kullanılır. Her iki kabın içeriğinin karıştırıldığı oranları ayarlamanıza izin veren, kontrol valfli bir cam tüp ile altta birbirleriyle iletişim kuran, kesinlikle tanımlanmış aynı çapa sahip iki silindirik kaptan oluşur. Bunlardan biri bir karıştırıcı ile donatılmıştır ve çözeltinin santrifüj tüplerine aktığı bir çıkışa sahiptir. Bir karıştırıcıya daha yoğun bir çözelti yerleştirilir; ikinci silindir daha düşük yoğunluklu bir çözelti ile doldurulur. Her iki silindirdeki çözelti sütununun yüksekliği, içlerindeki hidrostatik basınç aynı olacak şekilde ayarlanır. Daha yoğun çözelti, karıştırıcıdan kademeli olarak santrifüj tüplerine boşaltılır ve eş zamanlı olarak, kontrol valfi aracılığıyla ikinci silindirden karıştırıcıya giren eşit hacimde daha düşük yoğunluklu çözelti ile değiştirilir. Karıştırıcıdaki çözeltinin homojenliği, çözeltinin bir karıştırıcı ile sürekli karıştırılmasıyla sağlanır. Çözelti santrifüj tüplerine boşaltıldıkça yoğunluğu azalır ve tüplerde doğrusal bir yoğunluk gradyanı oluşur. Doğrusal olmayan gradyanlar, eşit olmayan çapta iki silindirden oluşan bir sistem kullanılarak oluşturulabilir.
Farklı diklikte yoğunluk gradyanları oluşturmak için, eşit olmayan yoğunluktaki çözeltilerle doldurulmuş, mekanik olarak kontrol edilen iki şırınga sistemi kullanılır. Pistonların nispi hızı değiştirilerek çeşitli gradyanlar oluşturulabilir.
2.5.4 Santrifüj tüplerinden gradyanların çıkarılması
Santrifüjleme tamamlandıktan ve partiküller ayrıldıktan sonra oluşan bölgelerin çıkarılması gerekir. Bu, çoğu zaman yer değiştirme yöntemiyle olmak üzere çeşitli şekillerde yapılır. Tabanda bir santrifüj tüpü delinir ve çok yoğun bir ortam, örneğin %60-70 sükroz çözeltisi yavaşça alt kısmına verilir. Üst çözeltinin yeri değiştirilir ve fraksiyonlar bir şırınga, pipet veya bir tüp vasıtasıyla bir fraksiyon toplayıcıya bağlanan özel bir cihaz kullanılarak toplanır. Tüpler selüloit veya nitroselülozdan yapılmışsa, tüp özel bir bıçakla kesilerek fraksiyonlar çıkarılır. Bunu yapmak için, bir standa sabitlenmiş bir santrifüj tüpü doğrudan istenen bölgenin altından kesilir ve fraksiyon bir şırınga veya pipet ile emilir. Uygun bir kesme cihazı tasarımı ile çözüm kaybı minimum olacaktır. Kesirlerin toplanması, test tüpünün tabanını ince, içi boş bir iğne ile delinerek de gerçekleştirilir. Tüpten iğne içinden akan damlalar, daha fazla analiz için bir fraksiyon toplayıcıda toplanır.
2.5.5 Hazırlayıcı santrifüjler ve uygulamaları
Hazırlayıcı santrifüjler üç ana gruba ayrılabilir: genel amaçlı santrifüjler, yüksek hızlı santrifüjler ve hazırlayıcı ultrasantrifüjler.Genel amaçlı santrifüjler maksimum 6000 rpm hız verin-1 ve OCU 6000'e kadarg . Birbirlerinden yalnızca kapasite bakımından farklıdırlar ve bir dizi değiştirilebilir rotora sahiptirler: açısal ve asılı camlı. Bu tip santrifüjlerin özelliklerinden biri büyük kapasiteleridir - 4 ila 6 dm arası3 , sadece 10.50 ve 100 cm santrifüj tüpleri ile yüklemenize izin vermez.3 , aynı zamanda kapasitesi 1,25 dm'ye kadar olan gemiler3 . Bu tipteki tüm santrifüjlerde, rotorlar tahrik miline sağlam bir şekilde monte edilmiştir ve içerikleriyle birlikte santrifüj tüpleri dikkatlice dengelenmeli ve ağırlıkları 0,25 g'dan fazla olmayacak şekilde simetrik olarak yerleştirilmelidir. diğer, böylece rotorun dönme eksenine göre test tüplerinin eşit dağılımını sağlar.
Yüksek hızlı santrifüjler 25.000 rpm'lik bir maksimum hız verin-1 ve OCU 89000'e kadarg. Rotor odası, rotorun dönüşü sırasında sürtünme nedeniyle oluşan ısınmayı önleyen bir soğutma sistemi ile donatılmıştır. Kural olarak, yüksek hızlı santrifüjlerin kapasitesi 1,5 dm'dir.3 ve hem açısal hem de asılı camlı değiştirilebilir rotorlarla donatılmıştır.
Hazırlayıcı ultrasantrifüjler 75.000 rpm'ye kadar maksimum hız verin-1 ve maksimum merkezkaç ivmesi 510.000g . Hava ile sürtünmesi nedeniyle rotorun aşırı ısınmasını önlemek için hem buzdolabı hem de vakum ünitesi ile donatılmıştır. Bu tür santrifüjlerin rotorları, yüksek mukavemetli alüminyum veya titanyum alaşımlarından yapılmıştır. Genellikle alüminyum alaşım rotorlar kullanılır, ancak özellikle yüksek hızların gerekli olduğu durumlarda titanyum rotorlar kullanılır. Santrifüj tüplerinin düzensiz doldurulmasından kaynaklanan rotor dengesizliğinden kaynaklanan titreşimi azaltmak için ultrasantrifüjlerde esnek bir şaft bulunur. Santrifüj tüpleri ve içerikleri en yakın 0,1 g'a dikkatlice dengelenmelidir.Genel kullanım için santrifüj rotorlarını yüklerken benzer gereksinimlere uyulmalıdır.
2.6 Rotorların tasarımı
2.6.1 Açılı rotorlar ve asılı kepçeli rotorlar
Hazırlayıcı santrifüjlerin rotorları genellikle iki tiptir - açılı ve asılı kovalar. Açısal olarak adlandırılırlar çünkü içlerine yerleştirilen santrifüj tüpleri her zaman dönme eksenine belirli bir açıdadır. Asılı camlı rotorlarda, test tüpleri dikey olarak monte edilir ve ortaya çıkan merkezkaç kuvvetinin etkisi altında döndürüldüğünde yatay konuma hareket eder; dönme eksenine olan eğim açısı 90°'dir.
Açısal rotorlarda, partiküllerin test tüpünün karşılık gelen duvarına kat ettiği mesafe çok küçüktür ve bu nedenle çökelme nispeten hızlı gerçekleşir. Test tüpünün duvarlarıyla çarpıştıktan sonra parçacıklar aşağı kayar ve altta bir tortu oluşturur. Santrifüjleme sırasında, benzer sedimantasyon özelliklerine sahip parçacıkların ayrılmasını büyük ölçüde zorlaştıran konveksiyon akışları ortaya çıkar. Bununla birlikte, benzer tasarıma sahip rotorlar, çökelme oranları oldukça değişken olan parçacıkları ayırmak için başarıyla kullanılmaktadır.
Asılı kaplara sahip rotorlarda konveksiyon olayları da gözlenir, ancak bunlar çok belirgin değildir. Konveksiyon, merkezkaç ivmesinin etkisi altında parçacıkların dönme eksenine tam olarak dik olmayan bir yönde yerleşmesinin ve bu nedenle açılı rotorlarda olduğu gibi test tüpünün duvarlarına çarpmasının ve kaymasının sonucudur. alt.
Asma çanak rotorlarda sektörel şekilli borular kullanılarak ve rotor hızı ayarlanarak konveksiyon ve girdap etkileri bir dereceye kadar önlenebilir; Yukarıda listelenen bir yoğunluk gradyanında santrifüjleme yöntemi de dezavantajlardan yoksundur.
2.6.2 Sürekli rotorlar
Sürekli rotorlar, örneğin kültür ortamından hücrelerin izolasyonu için, büyük hacimli süspansiyonlardan nispeten küçük miktarlarda katı malzemenin yüksek hızlı fraksiyonasyonu için tasarlanmıştır. Santrifüjleme sırasında, rotora sürekli olarak bir parçacık süspansiyonu eklenir; rotorun verimi, biriktirilen müstahzarın doğasına bağlıdır ve 100 cm'den değişir3 1 dm'ye kadar3 1 dakika içinde Rotorun özelliği, özel bir tasarıma sahip yalıtılmış bir oda olmasıdır; içeriği dış ortamla iletişim kurmaz ve bu nedenle kirlenmez veya püskürtülmez.
2.6.3 Bölgesel veya Anderson rotorları
Pirinç. 2 .6. Santrifüjleme adımları (a- e) bölgesel rotorda
Bölgesel rotorlar, çok önemli merkezkaç ivmelerine dayanabilen alüminyum veya titanyum alaşımlarından yapılmıştır. Genellikle çıkarılabilir bir kapakla kapatılmış silindirik bir boşluğa sahiptirler. Boşluğun içinde, dönme ekseninde, rotor boşluğunu dört sektöre bölen, üzerine bıçaklı bir nozülün yerleştirildiği eksenel bir tüp vardır. Kanatlar veya bölmeler, eksenel borudan rotorun çevresine bir gradyanın enjekte edildiği radyal kanallara sahiptir. Kanatların bu tasarımı sayesinde konveksiyon minimuma indirilmiştir.
Rotorun doldurulması, yaklaşık 3000 rpm hızında döndüğünde gerçekleştirilir.-1 . Rotorun çevresi boyunca eşit olarak dağıtılan ve merkezkaç kuvveti nedeniyle dönme eksenine dik dış duvarında tutulan en düşük yoğunluklu bir katmandan başlayarak rotora önceden oluşturulmuş bir gradyan pompalanır.. Daha sonra daha yüksek yoğunluklu gradyan katmanlarının eklenmesiyle, daha az yoğun katmanların merkezine doğru sürekli bir kayma meydana gelir. Tüm eğim rotora pompalandıktan sonra, yoğunluğu önceden oluşturulmuş eğimin en yüksek yoğunluğuyla aynı veya biraz daha fazla olan "yastık" adı verilen bir çözelti ile tam hacmine kadar doldurulur.
Ardından, eksenel tüp aracılığıyla test numunesi katmanlanır., daha düşük yoğunluklu bir çözelti kullanılarak tüpten rotorun hacmine kaydırılan, aynı zamanda, aynı "yastık" hacmi çevreden çıkarılır. Tüm bu işlemlerden sonra rotorun dönüş hızı çalışma hızına getirilir ve gerekli süre boyunca ya bölge-hız ya da bölge-izopik fraksiyonlama yapılır.. Fraksiyonların ekstraksiyonu 3000 rpm rotor hızında gerçekleştirilir.-1 . Rotorun içeriği, çevreden bir “yastık” eklenerek yer değiştirir, her şeyden önce daha az yoğun katmanlar yer değiştirir. Anderson rotorunun eksenel kanalının özel tasarımı nedeniyle, yer değiştirmeleri sırasında bölgelerin karışması yoktur. Giden gradyan, protein içeriğinin 280 nm'de absorpsiyonla belirlenebildiği bir spektrofotometre hücresi gibi bir kayıt cihazından veya özel bir radyoaktivite detektöründen geçirilir, ardından fraksiyonlar toplanır.
Orta hızlarda kullanılan bölgesel rotorların kapasitesi 650 ile 1600 cm arasında değişmektedir.3 , bu da oldukça fazla miktarda malzeme elde etmenizi sağlar. Bölgesel rotorlar, çeşitli müstahzarlardan protein kirleticilerini çıkarmak ve mitokondri, lizozom, polisom ve proteinleri izole etmek ve saflaştırmak için kullanılır.
2.6.4 Hücre altı fraksiyonların analizi
Fraksiyonasyon yoluyla elde edilen hücre altı partiküllerin preparasyonunun özellikleri, ancak preparasyon safsızlıklar içermiyorsa partiküllerin özelliklerine bağlanabilir. Bu nedenle, elde edilen müstahzarların saflığını değerlendirmek her zaman gereklidir. Homojenleştirmenin etkinliği ve preparasyondaki safsızlıkların varlığı mikroskobik inceleme ile belirlenebilir. Bununla birlikte, görünür safsızlıkların olmaması, ilacın saflığının henüz güvenilir bir kanıtı değildir. Elde edilen müstahzarın saflığını ölçmek için, içindeki proteinlerin veya DNA'nın içeriğini belirlemenize, mümkünse enzimatik aktivitesini ve immünolojik özelliklerini belirlemenize izin veren kimyasal analize tabi tutulur.
Parçalanmış dokularda enzimlerin dağılımının analizi iki genel prensibe dayanmaktadır. Bunlardan ilki, belirli bir hücre altı popülasyonunun tüm parçacıklarının aynı enzim setini içermesidir. İkincisi, her enzimin hücre içinde belirli bir yerde lokalize olduğunu varsayar. Bu konum doğru olsaydı, enzimler ilgili organeller için belirteç görevi görebilirdi: örneğin, sitokrom oksidaz ve monoamin oksidaz mitokondriyal belirteç enzimleri olarak, asit hidrolazlar lizozom belirteçleri olarak, katalaz bir peroksizom belirteci olarak ve glukoz-6- olarak hizmet edebilirdi. fosfataz - mikrozomal membran belirteci. Bununla birlikte, malat dehidrojenaz gibi bazı enzimlerin,R -glukuronidaz, NADP'H-sitokrom-c-redüktaz, birden fazla fraksiyonda lokalizedir. Bu nedenle, her özel durumda hücre altı fraksiyonların enzim-markerlerinin seçimine büyük bir dikkatle yaklaşılmalıdır. Ayrıca, bir işaretleyici enzimin olmaması, karşılık gelen organellerin yokluğu anlamına gelmez. Fraksiyonasyon sırasında enzimin organeller tarafından kaybolması veya inhibe edilmesi veya inaktive edilmesi muhtemeldir; bu nedenle, genellikle her fraksiyon için en az iki işaretleyici enzim belirlenir.
kesir
2.7 Diferansiyel santrifüjleme ile fraksiyonlama
2.7.1 Sonuçların sunumu
Doku fraksiyonasyonundan elde edilen sonuçlar en uygun şekilde grafikler şeklinde sunulur. Bu nedenle, dokulardaki enzimlerin dağılımını incelerken, veriler en iyi histogramlar şeklinde sunulur ve bu da deneylerin sonuçlarını görsel olarak değerlendirmeyi mümkün kılar.
Numunedeki protein içeriğinin enzimatik aktivitesi, hem orijinal homojenatta hem de her izole edilmiş hücre altı fraksiyonunda ayrı ayrı belirlenir. Fraksiyonlardaki toplam enzimatik aktivite ve protein içeriği, orijinal homojenattaki karşılık gelen değerlerden önemli ölçüde farklı olmamalıdır.
Daha sonra, her fraksiyondaki enzimatik aktivite ve protein içeriği, bir histogramın yapıldığı esas alınarak toplam verimin %'si olarak hesaplanır. Her fraksiyondaki nispi protein miktarı, izolasyon sırasına göre apsis ekseni boyunca sırayla çizilir ve her fraksiyonun nispi spesifik aktivitesi, ordinat ekseni boyunca çizilir. Böylece, her fraksiyonun enzimatik aktivitesi, sütunların alanından belirlenir.
2.7.2 Analitik ultrasantrifüjleme
Amacı maddeleri ayırmak ve saflaştırmak olan hazırlayıcı santrifüjlemeden farklı olarak, analitik ultrasantrifüjleme esas olarak biyolojik makromoleküllerin ve diğer yapıların çökelme özelliklerini incelemek için kullanılır. Bu nedenle, analitik santrifüjlemede özel tasarım rotorlar ve kayıt sistemleri kullanılır: malzemenin çökelmesini sürekli olarak izlemenizi sağlar.içinde merkezkaç alanı.
Analitik ultrasantrifüjler 70.000 rpm'ye kadar hızlara ulaşabilir -1 500.000'e kadar merkezkaç ivmesi yaratırkeng . Rotorları, kural olarak, bir elips şeklindedir ve motora bir ip vasıtasıyla bağlanır, bu da rotorun dönüş hızını değiştirmeyi mümkün kılar. Rotor, bir soğutma cihazı ile donatılmış bir vakum odasında döner ve santrifüjde dönme eksenine paralel olarak kesinlikle dikey olarak yerleştirilmiş analitik ve dengeleme olmak üzere iki hücreye sahiptir. Dengeleme hücresi, analitik hücreyi dengelemeye hizmet eder ve hassas sistemli metal bir bloktur. Ayrıca, analitik hücrede karşılık gelen mesafelerin belirlendiği, dönüş ekseninden kesin olarak tanımlanmış bir mesafede bulunan iki indeks deliğine sahiptir. Analitik hücre, tipik olarak 1 cm 3 , sektörel bir forma sahiptir. Rotora düzgün bir şekilde takıldığında, dik olmasına rağmen, asma kovalı rotor ile aynı prensipte çalışır ve neredeyse ideal çökelme koşulları yaratır. Analitik hücrenin uçlarında kuvars camlı pencereler bulunmaktadır. Analitik ultrasantrifüjler, tüm santrifüjleme periyodu boyunca partiküllerin sedimantasyonunun izlenmesine izin veren optik sistemlerle donatılmıştır. Önceden belirlenmiş zaman aralıklarında çöken materyalin fotoğrafı çekilebilir. Proteinleri ve DNA'yı parçalara ayırırken, sedimantasyon, ultraviyole ve incelenen çözeltilerin farklı kırılma indekslerine sahip olduğu durumlarda, bir schlieren sistemi veya bir Rayleigh girişim sistemi kullanılarak absorpsiyon ile izlenir. Son iki yöntem, ışığın farklı yoğunluktaki bölgelerden oluşan şeffaf bir çözeltiden geçtiğinde, ışığın bölge sınırında kırılması gerçeğine dayanmaktadır. Sedimantasyon sırasında, kırılma merceği görevi gören ağır ve hafif parçacıkların bulunduğu bölgeler arasında bir sınır oluşur; bu durumda detektör olarak kullanılan fotoğraf plakasında bir tepe noktası belirir. Sedimantasyon sırasında, sınır hareket eder ve sonuç olarak, hızı malzemenin sedimantasyon oranını değerlendirmek için kullanılabilen tepe noktası hareket eder. İnterferometrik sistemler, schlieren sistemlerinden daha hassastır. Analitik hücreler, en sık kullanılan tek sektörlü ve çözücü ve çözünenin karşılaştırmalı çalışması için kullanılan iki sektörlüdür.
Biyolojide, makromoleküllerin moleküler ağırlıklarını belirlemek, elde edilen örneklerin saflığını kontrol etmek ve makromoleküllerdeki konformasyonel değişiklikleri incelemek için analitik ultrasantrifüj kullanılır.
2.8 Analitik ultrasantrifüj uygulaması
2.8.1 Molekül ağırlıklarının belirlenmesi
Analitik ultrasantrifüj kullanarak moleküler ağırlıkları belirlemek için üç ana yöntem vardır: sedimantasyon hızı belirleme, sedimantasyon dengesi yöntemi ve sedimantasyon dengesi yaklaşımı yöntemi.
Sedimantasyon hızı ile moleküler ağırlığın belirlenmesi - bu en yaygın yöntemdir. Santrifüjleme yüksek hızlarda gerçekleştirilir, böylece başlangıçta hacim boyunca eşit olarak dağılmış olan parçacıklar, dönüş merkezinden yarıçap boyunca sırayla hareket etmeye başlar. Çözücünün zaten partikül içermeyen alanı ile bunları içeren kısmı arasında net bir arayüz oluşur. Bu sınır, santrifüjleme sırasında hareket eder; bu, yukarıdaki yöntemlerden birini kullanarak parçacıkların çökelme hızını belirlemeyi mümkün kılar ve bu hareketi bir fotoğraf plakasına kaydeder.
Sedimantasyon hızı aşağıdaki ilişki ile belirlenir:
neredeX - dönme ekseninden cm cinsinden uzaklık,
t - s cinsinden zaman,
w- rad-s cinsinden açısal hız -1 ,
s - sedimantasyon katsayısı "moleküller.
Sedimantasyon katsayısı, ivme birimi başına hızdır, ölçülürSeedberg birimleri ; 1 swedberg birimi 10'a eşittir _13 İle birlikte. Sayısal değersparçacıkların moleküler ağırlığına ve şekline bağlıdır ve belirli bir molekülün veya supramoleküler yapının bir değer özelliğidir. Örneğin, lizozimin sedimantasyon katsayısı 2.15'tir.S; katal aza'nın sedimantasyon faktörü 11.35'tir.S, bakteri ribozomlarının alt birimleri - 30'dan 50'yeS, ve ökaryotik ribozomların alt birimleri - 40'tan 60S'ye.
neredeM molekülün moleküler ağırlığıdır,R gaz sabitidir,T mutlak sıcaklık,smolekülün sedimantasyon katsayısıdır,D molekülün difüzyon katsayısıdır,v - bir gram çözünenin kapladığı hacim olarak kabul edilebilecek kısmi özgül hacim, p - çözücünün yoğunluğu.
Sedimantasyon dengesi yöntemi. Bu yöntemle moleküler ağırlıkların belirlenmesi, 7.000-8.000 rpm gibi nispeten düşük rotor hızlarında gerçekleştirilir. -1 böylece büyük moleküler ağırlığa sahip moleküller dibe çökmez. Ultrasantrifüj, bir yandan merkezkaç kuvvetlerinin etkisi altında kurulan parçacıklar dengeye ulaşana kadar, diğer yandan difüzyon kuvvetleri, yani parçacıkların hareketi durana kadar gerçekleştirilir. Daha sonra elde edilen konsantrasyon gradyanına göre maddenin moleküler ağırlığı formüle göre hesaplanır.
neredeR gaz sabitidir,T - mutlak sıcaklık, o - açısal hız, p - çözücünün yoğunluğu,v - kısmi özgül hacim,İle birlikte X veİle birlikte 2 mesafeler boyunca bir çözünenin konsantrasyonudurG G ve G 2 dönme ekseninden.
Bu yöntemin dezavantajı, sedimantasyon dengesine ulaşmanın uzun zaman almasıdır - santrifüjün sürekli çalışmasıyla birkaç günden birkaç haftaya kadar.
Sedimantasyon dengesine yaklaşma yöntemi, "dengelemek" için gereken büyük bir zaman yatırımıyla ilişkili önceki yöntemin dezavantajlarından kurtulmak için geliştirildi. Bu yöntemle, santrifüjlenmiş çözelti dengeye yakın bir durumdayken moleküler ağırlıkları belirlemek mümkündür. İlk olarak, makromoleküller analitik hücrenin tüm hacmine eşit olarak dağıtılır; daha sonra santrifüjleme ilerledikçe moleküller yerleşir ve menisküs bölgesindeki çözeltinin yoğunluğu giderek azalır. Yoğunluktaki değişiklik dikkatlice kaydedilir ve daha sonra çok sayıda değişken içeren karmaşık hesaplamalarla belirli bir bileşiğin moleküler ağırlığı aşağıdaki formüllerle belirlenir:
neredeR gaz sabitidir,T mutlak sıcaklık,v - kısmi özgül hacim, p - solvent yoğunluğu,dcldr - makromolekül konsantrasyon gradyanı, g mve G d- sırasıyla menisküse ve tüpün dibine olan mesafe, s mVe birlikte d- sırasıyla menisküsteki ve tüpün altındaki makromoleküllerin konsantrasyonu,M m veM R - Maddenin konsantrasyonunun sırasıyla menisküs ve test tüpünün altındaki dağılımı ile belirlenen moleküler ağırlık değerleri.
2.8.2 Müstahzarların saflığının değerlendirilmesi
Analitik ultrasantrifüj, DNA, virüs ve protein preparatlarının saflığını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Molekülün moleküler ağırlığının doğru bir şekilde belirlenmesinin gerekli olduğu durumlarda, preparatların saflığı şüphesiz çok önemlidir. Çoğu durumda, müstahzarın homojenliği, çökelme hızının belirlenmesi yöntemi kullanılarak çökelme sınırının doğasına göre değerlendirilebilir: homojen bir müstahzar genellikle kesin olarak tanımlanmış bir sınır verir. Müstahzarda bulunan safsızlıklar, ek bir tepe veya omuz olarak görünür; ayrıca ana tepe noktasının asimetrisini de belirlerler.
2.8.3 Makromoleküllerdeki konformasyonel değişikliklerin incelenmesi
Analitik ultrasantrifüjlemenin bir başka uygulama alanı, makromoleküllerdeki konformasyonel değişikliklerin incelenmesidir. DNA molekülü örneğin tek veya çift sarmallı, doğrusal veya dairesel olabilir. Çeşitli bileşiklerin etkisi altında veya yüksek sıcaklıklarda DNA, örneğin sedimantasyon hızı değiştirilerek belirlenebilen bir dizi tersinir ve geri dönüşü olmayan konformasyonel değişikliklere uğrar. Molekül ne kadar kompakt olursa, çözeltideki sürtünme katsayısı o kadar düşük olur ve bunun tersi de geçerlidir: ne kadar az kompakt olursa, sürtünme katsayısı o kadar büyük olur ve sonuç olarak o kadar yavaş çöker. Böylece, örneğin üzerinde çeşitli etkilerden önce ve sonra sedimantasyon hızındaki farklılıklar, makromoleküllerde meydana gelen konformasyonel değişikliklerin tespit edilmesini mümkün kılar.
Örneğin aspartat transkarbamoilaz gibi allosterik proteinlerde, bir substrata ve küçük ligandlara bağlanmalarının bir sonucu olarak konformasyonel değişiklikler meydana gelir. Bir proteinin alt birimlere ayrılması, onun üre veya parakloromerküribenzoat gibi maddelerle işlenmesiyle indüklenebilir. Tüm bu değişiklikler, analitik ultrasantrifüj kullanılarak kolayca izlenebilir.
Santrifüjleme, mekanik karışımların merkezkaç kuvvetinin etkisiyle bileşenlerine ayrılmasıdır. Bu amaçla kullanılan cihazlara santrifüj denir. Santrifüjün ana kısmı, içine monte edilmiş santrifüj tüpleri için yuvalara sahip bir rotordur. Rotor, yüksek hızda döner, bunun sonucunda, mekanik karışımların ayrıldığı, örneğin bir sıvı içinde süspanse edilen partiküller birikir, etkisi altında önemli merkezkaç kuvvetleri oluşturulur.
Santrifüjler: 1 - manuel: 2 - elektrikli tahrikli.
Klinik ve sıhhi laboratuvarlarda, kan plazmasından, idrarın sıvı kısmından yoğun partiküllerden vb. ayırmak için santrifüj kullanılır. Bu amaçla, manuel santrifüjler (Şekil 1) veya elektrikli santrifüjler kullanılır, dönme hızı hangi ayarlanabilir (Şek., 2).
Rotor hızı 40.000 rpm'yi aşan ultrasantrifüjler, genellikle deneysel uygulamada hücre organellerini ayırmak, kolloidal partikülleri, makromolekülleri vb. ayırmak için kullanılır.
Santrifüj, farklı yoğunluklara sahip sıvı ve katı bileşenlerden oluşan kaba sistemlerin santrifüj adı verilen özel aparatlar kullanılarak ayrılmasıdır. Santrifüjün çalışma prensibi, etkisi altında, santrifüj içine yerleştirilen karışımın bileşenlerinin ayrılma hızının, etki altında ayrılma oranlarına kıyasla birçok kez arttığı büyük bir merkezkaç kuvvetinin yaratılmasına dayanır. yerçekimi.
Santrifüj yöntemi biyoloji, tıp ve teknolojide yaygın olarak kullanılmaktadır ve genellikle filtreleme, çökeltme ve presleme işlemlerinin yerini almaktadır.
Santrifüjün bir mahfazası, bir tahrik mekanizması, bir rotoru, bir çalışma (kapalı) odası ve bir kontrol paneli vardır. Bazı santrifüjler, 5 ila 60 dakika aralığında otomatik kapanma ve frenleme sağlayan bir elektrikli saat ile donatılmıştır. Özel santrifüjlerde, takip ve otomatik kontrol cihazları bulunan soğutma ve vakum üniteleri bulunur. Herhangi bir santrifüjün ana kısmı rotordur (laboratuvar santrifüjlerinde genellikle dikey olarak monte edilmiş bir elektrik motor şaftı üzerinde bulunur veya motor şaftından çeşitli dişliler tarafından, hatta bazen manuel olarak döndürülür). Santrifüj rotoru, test tüplerinin yerleştirildiği, dönüş sırasında yatay bir pozisyon alan metal manşonlar için menteşeli soketlere sahip bir disktir (çapraz).
Bazen rotor, test tüpleri için hücrelerle (açısal rotor) katı metal kesilmiş bir koni şeklinde yapılır; içindeki borular, dönme eksenine (genellikle 40°) sabit bir açıyla yerleştirilmiştir. Test tüplerinin eğimli konumu ile karışımın bileşenleri daha hızlı ayrılır. Karışımın ayrılması, çeşitli şekil ve hacimlerdeki test tüplerinde gerçekleştirilir (Şekil 1). Yüksek hızlarda çalışırken, camlar patladığı için polietilenden yapılmış test tüpleri kullanılır. Rotorda birbirine karşı yerleştirilmiş işlenmiş malzemeye sahip test tüpleri dengelenmelidir. Bu, rotor mili üzerinde eşit bir yük sağlar ve santrifüj milinin eşit şekilde dönmesini sağlar. Test tüplerini dengelemek için özel teraziler kullanılır (Şekil 2).
Pirinç. 1. Santrifüjleme için tüpler.
Pirinç. 2. Santrifüj terazileri.
Endüstride kullanılan santrifüjler, laboratuvar santrifüjlerinden daha karmaşık rotor tasarımıyla farklılık gösterir, bu da aynı anda çok miktarda malzemeyi santrifüj etmeyi veya ayırma işlemlerini sürekli olarak gerçekleştirmeyi mümkün kılar.
Düşük rotor hızına sahip santrifüjler, tıpta idrar tortularını, kan serumunu pıhtılardan ayırmak, eritrosit çökeltmesi, serolojik çalışmalarda vb.
Mikrosantrifüj (Şekil 4) manuel olarak çalıştırılır; biri mikrotüpler için yuvalara sahip olan ve kanın uyumluluğunu belirlemek için kullanılan iki değiştirilebilir ağızlıkla donatılmıştır; diğeri - dereceli bir mikropipet (hematokrit) yerleştirmek için bir soket ile - kan hücrelerinin yüzdesini belirlemeye yöneliktir.
Pirinç. 3. Manuel santrifüj.
Pirinç. 4. Mikrosantrifüj.
Manuel santrifüjde (Şekil 3) 15 ml tüpler için dört metal veya plastik kılıf bulunur.
Laboratuvar klinik santrifüjü TsLK-1 (Şekil 5, 7) üç dönüş hızına (1000, 1500, 3000 rpm) sahiptir. Çapraz rotor, 12 geleneksel santrifüj tüpü için uyarlanmıştır. Santrifüjlenmiş sıvının en büyük hacmi 150 ml'dir.
Yüksek rotor hızına sahip santrifüjler, çoğu durumda farklı sıvı hacimleri için tasarlanmış değiştirilebilir rotorlarla donatılmıştır ve ince süspansiyonları ayırmak için kullanılır.
Laboratuvar masaüstü santrifüjü TsLN-2 (Şekil 5, 2) toplam 72 ml kapasiteli altı kısa test tüpü için açılı bir rotora sahiptir. Maksimum dönüş hızı -9000 rpm.
Pirinç. 5. Çeşitli laboratuvar santrifüjleri: 1 - klinik; 2 - masaüstü; 3 - küçük köşe; 4 - sabit; 5 - buzdolabı.
Küçük açılı santrifüj TsUM-1 (Şekil 5, 3), farklı sayıda test tüpü ve hematokrit içeren üç adet değiştirilebilir açılı rotora sahiptir: toplam kapasitesi 150 ml olan 6 test tüpü için bir rotor, toplamda 10 test tüpü için bir rotor 120 ml kapasiteli, toplam 120 ml kapasiteli 24 test tüpü için bir rotor, iki kılcal damar için hematokrit. Maksimum dönüş hızı 10.000 rpm'dir.
Santrifüj, bir elektrikli saat mekanizması ile donatılmıştır.
Laboratuvar sabit santrifüjü CLS-2 (Şekil 5, 4) iki adet değiştirilebilir rotora sahiptir. Çapraz rotor, 500 ml kapasiteli dört çelik manşon ve bunlar için 250 ml kapasiteli dört cam test tüpü ile donatılmıştır. Açılı rotor, 50-75 ml kapasiteli 8 polietilen ve çelik test tüpü ile tedarik edilir. Rotorların maksimum dönüşü 6000 rpm'ye kadardır. Santrifüj, bir elektrikli saat mekanizması ile donatılmıştır.
Özel santrifüjler arasında, oda sıcaklığında bile değişen çeşitli maddelerin - çoğunlukla protein süspansiyonları - düşük sıcaklıklarda (-5 ° ve üzeri) santrifüjlenmesi amaçlanan laboratuvar soğutmalı santrifüj CLR-1 (Şekil 5.5) bulunur. Santrifüj, farklı santrifüjleme modları sağlayan üç adet değiştirilebilir rotora sahiptir. İki rotor, teknik özelliklerde TsLS-2 tipi santrifüjün rotorlarıyla aynıdır, ek bir aksa yerleştirilen üçüncü rotor, 18.000-18.500 rpm geliştirir. Çalışma ilacının maksimum hacmi 48 ml'dir. Santrifüj, bir elektrikli saat mekanizması ile donatılmıştır. Çalışma odasının soğutulması, bir soğutma makinesi kullanılarak gerçekleştirilir.
Ayrıca bkz. Ultrasantrifüjleme.
ders çalışması
santrifüj
1. Yöntemin prensibi
Maddelerin santrifüjleme ile ayrılması, bir santrifüj alanındaki parçacıkların farklı davranışlarına dayanır. Bir test tüpüne yerleştirilen parçacıkların süspansiyonu, santrifüj tahrik miline monte edilmiş bir rotora yüklenir.
Bir merkezkaç alanında, farklı yoğunluklara, şekillere veya boyutlara sahip parçacıklar farklı oranlarda biriktirilir. Sedimantasyon hızı, rotorun açısal hızı ve parçacık ile dönme ekseni arasındaki mesafe ile doğru orantılı olan merkezkaç ivmesine bağlıdır:
ve merkezkaç ivmesi daha sonra olacak
Rotorun bir devri 2n radyan olduğundan, rotorun dakikadaki devir cinsinden açısal hızı şu şekilde yazılabilir:
Merkezkaç ivmesi genellikle g birimiyle ifade edilir ve bağıl merkezkaç ivmesi olarak adlandırılır, yani.
Parçacıkları ayırma koşullarını listelerken, rotorun dönüş hızını ve yarıçapını ve ayrıca santrifüjleme süresini belirtin. Santrifüj ivmesi genellikle bir santrifüj tüpündeki sıvı kolonunun ortalama dönüş yarıçapından hesaplanan g birimiyle ifade edilir. Denklemi temel alarak, Dole ve Kotzias, GCF'nin rotor hızına ve r yarıçapına bağımlılığını ifade eden bir nomogram derlediler.
Küresel parçacıkların çökelme hızı, yalnızca merkezkaç ivmesine değil, aynı zamanda parçacıkların yoğunluğuna ve yarıçapına ve süspansiyon ortamının viskozitesine de bağlıdır. Sıvı bir ortamdaki küresel bir parçacığın sıvı menisküsten santrifüj tüpünün dibine kadar çökelmesi için gereken süre, çökelme hızı ile ters orantılıdır ve aşağıdaki denklem ile belirlenir:
burada t saniye cinsinden çökelme süresidir, rj ortamın viskozitesidir, rh parçacığın yarıçapıdır, rf parçacığın yoğunluğudur, p ortamın yoğunluğudur, hm dönme ekseninden olan mesafedir sıvının menisküsüne, burada dönme ekseninden test tüpünün dibine kadar olan mesafe.
Denklemden aşağıdaki gibi, belirli bir rotor hızında, homojen küresel parçacıkların tortulaşması için gereken süre, yarıçaplarının karesi ve parçacık ve ortam yoğunluklarındaki fark ile ters orantılıdır ve ortamın viskozitesi ile doğru orantılıdır. . Bu nedenle, yoğunluk ve boyut olarak farklılık gösteren heterojen, yaklaşık olarak küresel parçacıkların bir karışımı, belirli bir ivmede tüpün dibine yerleşmelerinin farklı zamanları nedeniyle veya çöken parçacıkların tüp boyunca dağılımı nedeniyle ayrılabilir. belirli bir süre sonra kurulan. Maddeleri ayırırken, ortamın yoğunluğu ve viskozitesi gibi önemli faktörleri hesaba katmak gerekir. Tarif edilen yöntemler, hücre organellerini doku homojenatlarından ayırabilir. Hücrenin ana bileşenleri şu sırayla biriktirilir: önce tüm hücreler ve bunların parçaları, ardından çekirdekler, kloroplastlar, mitokondri, lizozomlar, mikrozomlar ve son olarak ribozomlar. Küresel olmayan parçacıkların çökmesi denkleme uymaz, bu nedenle aynı kütleye sahip ancak farklı şekillerdeki parçacıklar farklı hızlarda biriktirilir. Bu özellik, makromoleküllerin konformasyonunun ultrasantrifüjünün kullanıldığı çalışmada kullanılmıştır.
Hazırlayıcı santrifüjleme, sonraki biyokimyasal çalışmalar için biyolojik materyalin izole edilmesinden oluşur. Bu durumda, örneğin kesikli veya sürekli kültürlerden mikrobiyal hücrelerin aşılanmasının yanı sıra doku ve kan plazma kültürlerinden bitki ve hayvan hücrelerinin aşılanması gibi büyük miktarlarda başlangıç biyolojik materyali alınabilir. Hazırlayıcı santrifüjleme yardımıyla, morfolojilerini, yapılarını ve biyolojik aktivitelerini incelemek için çok sayıda hücre parçacığı izole edilir. Yöntem aynı zamanda DNA ve proteinler gibi biyolojik makromolekülleri önceden saflaştırılmış preparasyonlardan izole etmek için de kullanılır.
Analitik santrifüjleme esas olarak ribozomlar gibi makromoleküllerin veya parçacıkların saf veya büyük ölçüde saf preparasyonlarını incelemek için kullanılır. Bu durumda, az miktarda malzeme kullanılır ve çalışılan parçacıkların çökelmesi, özel optik sistemler kullanılarak sürekli olarak kaydedilir. Yöntem, malzemenin saflığı, moleküler ağırlığı ve yapısı hakkında veri elde edilmesini sağlar. Lisans atölyelerinde, hazırlıklı santrifüjleme, analitik santrifüjlemeye göre çok daha sık kullanılır, bu nedenle her iki yöntem de ortak ilkelere dayanmasına rağmen, buna daha ayrıntılı olarak odaklanacağız.
2. Hazırlayıcı santrifüjleme
2.1 Diferansiyel santrifüjleme
Bu yöntem, boyut ve yoğunluk olarak birbirinden farklı olan parçacıkların sedimantasyon hızlarındaki farklılıklara dayanmaktadır. Ayrıştırılacak malzeme, örneğin bir doku homojenatı, santrifüj ivmesinde kademeli bir artışla santrifüjlenir; bu, her aşamada tüpün tabanında belirli bir fraksiyon bırakılacak şekilde seçilir. Her adımın sonunda, çökelti süpernatandan ayrılır ve sonunda saf çökeltilmiş bir fraksiyon elde etmek için birkaç kez yıkanır. Ne yazık ki, tamamen saf bir çökelti elde etmek pratikte imkansızdır; Bunun neden olduğunu anlamak için, her santrifüjleme adımının başlangıcında santrifüj tüpünde meydana gelen sürece dönelim.
İlk olarak, homojenatın tüm parçacıkları santrifüj tüpünün hacmi üzerinde eşit olarak dağıtılır, bu nedenle bir santrifüjleme döngüsünde en ağır parçacıkların çökeltilerinin saf hazırlıklarını elde etmek imkansızdır: oluşan ilk çökelti esas olarak en ağır parçacıkları içerir, ancak, ayrıca, tüm ilk bileşenlerin belirli bir miktarı. Ağır parçacıkların yeterince saf bir şekilde hazırlanması, yalnızca ilk çökeltinin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ve santrifüjlenmesiyle elde edilebilir. Süpernatantın daha fazla santrifüjlenmesi ve ardından santrifüj ivmesinde bir artış, orta büyüklükte ve yoğunluktaki parçacıkların tortulaşmasına ve ardından en düşük yoğunluğa sahip en küçük parçacıkların tortulaşmasına yol açar. Şek. 2.3, bir sıçan karaciğer homojenatının fraksiyonlanmasının bir diyagramıdır.
Diferansiyel santrifüjleme, hücre organellerini doku homojenatlarından izole etmek için en yaygın yöntem gibi görünmektedir. Bu yöntem, büyüklük ve yoğunluk bakımından birbirinden önemli ölçüde farklı olan bu tür hücre organellerini ayırmak için en başarılı şekilde kullanılır. Ancak bu durumda bile, elde edilen fraksiyonlar hiçbir zaman tam olarak homojen değildir ve bunların daha fazla ayrılması için aşağıda açıklanan diğer yöntemler kullanılır. Organel yoğunluğundaki farklılıklara dayanan bu yöntemler, sürekli veya kademeli yoğunluk gradyanına sahip çözeltilerde santrifüj yaparak daha verimli ayırma sağlar. Bu yöntemlerin dezavantajı, çözeltinin yoğunluk gradyanını elde etmenin zaman almasıdır.
2.2 Hız bölgeli santrifüjleme
Bölgesel hız yöntemi veya aynı zamanda s-bölgesel santrifüjleme olarak da adlandırıldığı gibi, test numunesinin sürekli bir yoğunluk gradyanı ile bir çözeltinin yüzeyinde katmanlanmasından oluşur. Numune daha sonra parçacıklar ayrı bölgeler veya bantlarda gradyan boyunca dağılana kadar santrifüjlenir. Bir yoğunluk gradyanı oluşturarak, konveksiyondan kaynaklanan bölgelerin karışmasını önlemek mümkündür. Hız bölgeli santrifüj yöntemi, RNA-DNA hibritlerini, ribozom alt birimlerini ve diğer hücresel bileşenleri ayırmak için kullanılır.
2.3 İzopiknik santrifüjleme
İzopiknik santrifüj, hem yoğunluk gradyanında hem de olağan şekilde gerçekleştirilir. Santrifüjleme bir yoğunluk gradyanında gerçekleştirilmezse, hazırlık önce santrifüjlenir, böylece moleküler ağırlığı incelenen partiküllerinkinden daha büyük olan partiküller çöker. Bu ağır partiküller atılır ve numune, yoğunluğu izole edilecek fraksiyonunkiyle aynı olan bir ortam içinde süspanse edilir ve daha sonra incelenen partiküller tüpün dibine çökene ve daha düşük yoğunluklu partiküller tüpe yüzene kadar santrifüjlenir. sıvının yüzeyi...
Diğer bir yol, numuneyi, karışımın tüm bileşenlerinin yoğunluk aralığını kapsayan sürekli bir yoğunluk gradyanı ile çözeltinin yüzeyi üzerine katmanlamaktır. Santrifüjleme, partiküllerin kaldırma yoğunluğu karşılık gelen bölgelerin yoğunluğuna eşit olana kadar, yani partiküller bölgelere ayrılana kadar gerçekleştirilir. Yöntem, bölgesel izopiknik veya rezonant santrifüj olarak adlandırılır, çünkü buradaki ana nokta, parçacıkların boyutu veya şekli değil, kaldırma yoğunluğudur. Partiküllerin izopiknal bantlar oluşturduğu yoğunluk miktarı, süspansiyon ortamının doğasından etkilenir; parçacıklar çözeltideki bazı bileşiklere karşı geçirgenken, diğerlerine karşı geçirimsiz olabilir veya çözelti moleküllerini bağlayabilirler. Bölgesel rotor kullanıldığında, mitokondri, lizozomlar, peroksizomlar ve mikrozomlar sırasıyla 1.18, 1.21, 1.21 ve 1.10 g-cm-3 yoğunluğa karşılık gelen %42, %47, %47 ve %27 sakarozlu bantlarda konsantre edilir. Hücre altı organellerin yoğunluğu ayrıca belirli bileşiklerin seçici alımına da bağlıdır. Hemolize neden olmayan deterjan Triton WR-1339'un sıçanlara tanıtılması, karaciğer lizozomlarının boyutunda bir artışa ve yoğunluğunda bir azalmaya yol açar; mitokondri ve peroksizomların yoğunluğu değişmeden kalır. Lizozomların sedimantasyon özelliklerinin bir kural olarak değişmemesine rağmen, sakaroz gradyanındaki denge yoğunlukları 1.21'den 1.1'e düşer, bu da lizozomal-peroksizomal fraksiyonun karşılık gelen bir ayrılmasına yol açar. Bu özellik, mikrozomlardan daha büyük bir yoğunluğa sahip tüm parçacıkların homojen bir ortamdan çıkarılmasına ve ardından çökeltilmiş ağır parçacıkların izopiknal santrifüjlenmesine dayalı olarak lizozomların, mitokondrilerin ve peroksizomların nicel olarak ayrılmasında kullanılır.
2.4 Denge yoğunluğu gradyan santrifüjü
Bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için rubidyum veya sezyum gibi ağır metal tuzlarının yanı sıra sakaroz çözeltileri kullanılır. DNA gibi bir numune, konsantre bir sezyum klorür çözeltisi ile karıştırılır. Hem çözünen hem de çözücü başlangıçta hacim boyunca eşit olarak dağıtılır. Santrifüjleme sırasında, sezyum iyonlarının büyük bir kütlesi olduğundan, konsantrasyonun ve dolayısıyla CsCl'nin yoğunluğunun bir denge dağılımı kurulur. Santrifüj ivmesinin etkisi altında, DNA molekülleri yeniden dağıtılır ve bunlara karşılık gelen yoğunluğa sahip test tüpünün bir bölümünde ayrı bir bölge şeklinde toplanır. Yöntem esas olarak analitik santrifüjlemede kullanılır ve Meselson ve Stahl tarafından E. coli DNA replikasyonu mekanizmasını incelemek için kullanılmıştır. Denge yoğunluğu gradyanlı santrifüjleme aynı zamanda insan plazma lipoproteinlerini ayırma ve inceleme yöntemlerinden biridir.
2.5 Degradeleri şekillendirme ve ayıklama
2.5.1 Gradyanların doğası
Çözeltilerin yoğunluk gradyanlarını oluşturmak için, çoğunlukla, bazen sabit bir pH ile sakaroz çözeltileri kullanılır. Bazı durumlarda normal su yerine D2 0 kullanılarak iyi bir ayırma elde edilir. 2.1 bazı sakaroz çözeltilerinin özelliklerini gösterir.
Gradyanın seçimi, belirli fraksiyonlama görevleri tarafından belirlenir. Örneğin, Pharmacia FineChemicals tarafından üretilen ficol, yüksek yoğunluklu ve düşük ozmotik basınçlı gradyanlar oluşturmanın gerekli olduğu durumlarda sakarozun yerini alabilir. Ficol'ün bir diğer avantajı da hücre zarlarından geçmemesidir. Rubidyum ve sezyum gibi ağır metal tuzları daha yüksek yoğunluklu gradyanlar oluşturmak için kullanılır, ancak CsCl'nin aşındırıcı etkisinden dolayı bu gradyanlar sadece titanyum gibi dirençli metallerden yapılmış rotorlarda kullanılır.
2.5.2 Adım Yoğunluğu Gradyan Tekniği
Bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için, art arda azalan yoğunluğa sahip birkaç çözelti, bir pipet kullanılarak bir santrifüj tüpüne dikkatlice verilir. Daha sonra, en düşük yoğunluğa sahip olan en üst katmanda, numune dar bir bölge şeklinde katmanlanır ve ardından tüp santrifüjlenir. Çözeltinin uzun süre bekletilmesi sırasında adım adım gradyanların yumuşatılmasıyla düzgün doğrusal gradyanlar elde edilebilir. Tüpün içeriği bir tel ile hafifçe karıştırılarak veya tüp hafifçe çalkalanarak işlem hızlandırılabilir.
2.5.3 Düzgün yoğunluk gradyanı oluşturma tekniği
Çoğu durumda, düzgün bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için özel bir cihaz kullanılır. Her iki kabın içeriğinin karıştırıldığı oranları ayarlamanıza izin veren, kontrol valfli bir cam tüp ile altta birbirleriyle iletişim kuran, kesinlikle tanımlanmış aynı çapa sahip iki silindirik kaptan oluşur. Bunlardan biri bir karıştırıcı ile donatılmıştır ve çözeltinin santrifüj tüplerine aktığı bir çıkışa sahiptir. Bir karıştırıcıya daha yoğun bir çözelti yerleştirilir; ikinci silindir daha düşük yoğunluklu bir çözelti ile doldurulur. Her iki silindirdeki çözelti sütununun yüksekliği, içlerindeki hidrostatik basınç aynı olacak şekilde ayarlanır. Daha yoğun çözelti, karıştırıcıdan kademeli olarak santrifüj tüplerine boşaltılır ve eş zamanlı olarak, kontrol valfi aracılığıyla ikinci silindirden karıştırıcıya giren eşit hacimde daha düşük yoğunluklu çözelti ile değiştirilir. Karıştırıcıdaki çözeltinin homojenliği, çözeltinin bir karıştırıcı ile sürekli karıştırılmasıyla sağlanır. Çözelti santrifüj tüplerine boşaltıldıkça yoğunluğu azalır ve tüplerde doğrusal bir yoğunluk gradyanı oluşur. Doğrusal olmayan gradyanlar, eşit olmayan çapta iki silindirden oluşan bir sistem kullanılarak oluşturulabilir.
Farklı diklikte yoğunluk gradyanları oluşturmak için, eşit olmayan yoğunluktaki çözeltilerle doldurulmuş, mekanik olarak kontrol edilen iki şırınga sistemi kullanılır. Pistonların nispi hızı değiştirilerek çeşitli gradyanlar oluşturulabilir.
2.5.4 Santrifüj tüplerinden gradyanların çıkarılması
Santrifüjleme tamamlandıktan ve partiküller ayrıldıktan sonra oluşan bölgelerin çıkarılması gerekir. Bu, çoğu zaman yer değiştirme yöntemiyle olmak üzere çeşitli şekillerde yapılır. Tabanda bir santrifüj tüpü delinir ve çok yoğun bir ortam, örneğin %60-70 sükroz çözeltisi yavaşça alt kısmına verilir. Üst çözeltinin yeri değiştirilir ve fraksiyonlar bir şırınga, pipet veya bir tüp vasıtasıyla bir fraksiyon toplayıcıya bağlanan özel bir cihaz kullanılarak toplanır. Tüpler selüloit veya nitroselülozdan yapılmışsa, tüp özel bir bıçakla kesilerek fraksiyonlar çıkarılır. Bunu yapmak için, bir standa sabitlenmiş bir santrifüj tüpü doğrudan istenen bölgenin altından kesilir ve fraksiyon bir şırınga veya pipet ile emilir. Uygun bir kesme cihazı tasarımı ile çözüm kaybı minimum olacaktır. Kesirlerin toplanması, test tüpünün tabanını ince, içi boş bir iğne ile delinerek de gerçekleştirilir. Tüpten iğne içinden akan damlalar, daha fazla analiz için bir fraksiyon toplayıcıda toplanır.
2.5.5 Hazırlayıcı santrifüjler ve uygulamaları
Hazırlayıcı santrifüjler üç ana gruba ayrılabilir: genel amaçlı santrifüjler, yüksek hızlı santrifüjler ve hazırlayıcı ultrasantrifüjler. Genel amaçlı santrifüjler maksimum 6000 rpm hız ve 6000 g'a kadar RCF verir. Birbirlerinden yalnızca kapasite bakımından farklıdırlar ve bir dizi değiştirilebilir rotora sahiptirler: açısal ve asılı camlı. Bu tip santrifüjlerin özelliklerinden biri, büyük kapasiteleridir - 4 ila 6 dm3 arasında, bu da sadece 10.50 ve 100 cm3 santrifüj tüpleriyle değil, aynı zamanda 1.25 dm3'e kadar kapasiteye sahip kaplarla da yüklenmelerine izin verir. Bu tipteki tüm santrifüjlerde, rotorlar tahrik miline sağlam bir şekilde monte edilmiştir ve içerikleriyle birlikte santrifüj tüpleri dikkatlice dengelenmeli ve ağırlıkları 0,25 g'dan fazla olmayacak şekilde simetrik olarak yerleştirilmelidir. diğer, böylece rotorun dönme eksenine göre test tüplerinin eşit dağılımını sağlar.
Yüksek hızlı santrifüjler, 25.000 rpm-1 maksimum hız ve 89.000 g'a kadar RCF verir. Rotor odası, rotorun dönüşü sırasında sürtünme nedeniyle oluşan ısınmayı önleyen bir soğutma sistemi ile donatılmıştır. Kural olarak, yüksek hızlı santrifüjler 1,5 dm3 kapasiteye sahiptir ve hem açılı hem de asılı kovalar olan değiştirilebilir rotorlarla donatılmıştır.
Hazırlayıcı ultrasantrifüjler 75.000 rpm'ye kadar maksimum hız ve 510.000 g maksimum santrifüj ivmesi sağlar. Hava ile sürtünmesi nedeniyle rotorun aşırı ısınmasını önlemek için hem buzdolabı hem de vakum ünitesi ile donatılmıştır. Bu tür santrifüjlerin rotorları, yüksek mukavemetli alüminyum veya titanyum alaşımlarından yapılmıştır. Genellikle alüminyum alaşım rotorlar kullanılır, ancak özellikle yüksek hızların gerekli olduğu durumlarda titanyum rotorlar kullanılır. Santrifüj tüplerinin düzensiz doldurulmasından kaynaklanan rotor dengesizliğinden kaynaklanan titreşimi azaltmak için ultrasantrifüjlerde esnek bir şaft bulunur. Santrifüj tüpleri ve içerikleri en yakın 0,1 g'a dikkatlice dengelenmelidir.Genel kullanım için santrifüj rotorlarını yüklerken benzer gereksinimlere uyulmalıdır.
2.6 Rotorların tasarımı
2.6.1 Açılı rotorlar ve asılı kepçeli rotorlar
Hazırlayıcı santrifüjlerin rotorları genellikle iki tiptir - açılı ve asılı kovalar. Açısal olarak adlandırılırlar çünkü içlerine yerleştirilen santrifüj tüpleri her zaman dönme eksenine belirli bir açıdadır. Asılı camlı rotorlarda, test tüpleri dikey olarak monte edilir ve ortaya çıkan merkezkaç kuvvetinin etkisi altında döndürüldüğünde yatay konuma hareket eder; dönme eksenine olan eğim açısı 90°'dir.
Açısal rotorlarda, partiküllerin test tüpünün karşılık gelen duvarına kat ettiği mesafe çok küçüktür ve bu nedenle çökelme nispeten hızlı gerçekleşir. Test tüpünün duvarlarıyla çarpıştıktan sonra parçacıklar aşağı kayar ve altta bir tortu oluşturur. Santrifüjleme sırasında, benzer sedimantasyon özelliklerine sahip parçacıkların ayrılmasını büyük ölçüde zorlaştıran konveksiyon akışları ortaya çıkar. Bununla birlikte, benzer tasarıma sahip rotorlar, çökelme oranları oldukça değişken olan parçacıkları ayırmak için başarıyla kullanılmaktadır.
Asılı kaplara sahip rotorlarda konveksiyon olayları da gözlenir, ancak bunlar çok belirgin değildir. Konveksiyon, merkezkaç ivmesinin etkisi altında parçacıkların dönme eksenine tam olarak dik olmayan bir yönde yerleşmesinin ve bu nedenle açılı rotorlarda olduğu gibi test tüpünün duvarlarına çarpmasının ve kaymasının sonucudur. alt.
Asma çanak rotorlarda sektörel şekilli borular kullanılarak ve rotor hızı ayarlanarak konveksiyon ve girdap etkileri bir dereceye kadar önlenebilir; Yukarıda listelenen bir yoğunluk gradyanında santrifüjleme yöntemi de dezavantajlardan yoksundur.
2.6.2 Sürekli rotorlar
Sürekli rotorlar, örneğin kültür ortamından hücrelerin izolasyonu için, büyük hacimli süspansiyonlardan nispeten küçük miktarlarda katı malzemenin yüksek hızlı fraksiyonasyonu için tasarlanmıştır. Santrifüjleme sırasında, rotora sürekli olarak bir parçacık süspansiyonu eklenir; rotorun kapasitesi, bırakılan müstahzarın doğasına bağlıdır ve dakikada 100 cm3 ila 1 dm3 arasında değişir. Rotorun özelliği, özel bir tasarıma sahip yalıtılmış bir oda olmasıdır; içeriği dış ortamla iletişim kurmaz ve bu nedenle kirlenmez veya püskürtülmez.
2.6.3 Bölgesel veya Anderson rotorları
Bölgesel rotorlar, çok önemli merkezkaç ivmelerine dayanabilen alüminyum veya titanyum alaşımlarından yapılmıştır. Genellikle çıkarılabilir bir kapakla kapatılmış silindirik bir boşluğa sahiptirler. Boşluğun içinde, dönme ekseninde, rotor boşluğunu dört sektöre bölen, üzerine bıçaklı bir nozülün yerleştirildiği eksenel bir tüp vardır. Kanatlar veya bölmeler, eksenel borudan rotorun çevresine bir gradyanın enjekte edildiği radyal kanallara sahiptir. Kanatların bu tasarımı sayesinde konveksiyon minimuma indirilmiştir.
Rotorun doldurulması, yaklaşık 3000 rpm-1 hızında döndüğünde gerçekleştirilir. Rotorun çevresi boyunca eşit olarak dağıtılan ve merkezkaç kuvveti nedeniyle dönme eksenine dik dış duvarında tutulan en düşük yoğunluklu bir katmandan başlayarak rotora önceden oluşturulmuş bir gradyan pompalanır. Daha sonra daha yüksek yoğunluklu gradyan katmanlarının eklenmesiyle, daha az yoğun katmanların merkezine doğru sürekli bir kayma meydana gelir. Tüm eğim rotora pompalandıktan sonra, yoğunluğu önceden oluşturulmuş eğimin en yüksek yoğunluğuyla aynı veya biraz daha fazla olan "yastık" adı verilen bir çözelti ile tam hacmine kadar doldurulur.
Daha sonra, eksenel tüp boyunca, test numunesi katmanlanır, bu da daha düşük yoğunluklu bir çözelti kullanılarak tüpten rotor hacmine kaydırılırken, aynı hacimde "yastık" çevreden çıkarılır. Tüm bu işlemlerden sonra rotorun dönüş hızı çalışma hızına göre ayarlanır ve gerekli süre boyunca ya bölge-hız ya da bölge-izopik fraksiyonlama yapılır. Fraksiyonların ekstraksiyonu 3000 rpm - dak-1 rotor hızında gerçekleştirilir. Rotorun içeriği, çevreden bir "yastık" eklenerek yer değiştirir, her şeyden önce daha az yoğun katmanlar yer değiştirir. Anderson rotorunun eksenel kanalının özel tasarımı nedeniyle, yer değiştirmeleri sırasında bölgelerin karışması yoktur. Giden gradyan, protein içeriğinin 280 nm'de absorpsiyonla belirlenebildiği bir spektrofotometre hücresi gibi bir kayıt cihazından veya özel bir radyoaktivite detektöründen geçirilir, ardından fraksiyonlar toplanır.
Orta hızlarda kullanılan bölgesel rotorların kapasitesi 650 ile 1600 cm3 arasında değişmekte olup, bu da oldukça fazla miktarda malzeme elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bölgesel rotorlar, çeşitli müstahzarlardan protein kirleticilerini çıkarmak ve mitokondri, lizozom, polisom ve proteinleri izole etmek ve saflaştırmak için kullanılır.
2.6.4 Hücre altı fraksiyonların analizi
Fraksiyonasyon yoluyla elde edilen hücre altı partiküllerin preparasyonunun özellikleri, ancak preparasyon safsızlıklar içermiyorsa partiküllerin özelliklerine bağlanabilir. Bu nedenle, elde edilen müstahzarların saflığını değerlendirmek her zaman gereklidir. Homojenleştirmenin etkinliği ve preparasyondaki safsızlıkların varlığı mikroskobik inceleme ile belirlenebilir. Bununla birlikte, görünür safsızlıkların olmaması, ilacın saflığının henüz güvenilir bir kanıtı değildir. Elde edilen müstahzarın saflığını ölçmek için, içindeki proteinlerin veya DNA'nın içeriğini belirlemenize, mümkünse enzimatik aktivitesini ve immünolojik özelliklerini belirlemenize izin veren kimyasal analize tabi tutulur.
Parçalanmış dokularda enzimlerin dağılımının analizi iki genel prensibe dayanmaktadır. Bunlardan ilki, belirli bir hücre altı popülasyonunun tüm parçacıklarının aynı enzim setini içermesidir. İkincisi, her enzimin hücre içinde belirli bir yerde lokalize olduğunu varsayar. Bu konum doğru olsaydı, enzimler ilgili organeller için belirteç görevi görebilirdi: örneğin, sitokrom oksidaz ve monoamin oksidaz mitokondriyal belirteç enzimleri olarak, asit hidrolazlar lizozom belirteçleri olarak, katalaz bir peroksizom belirteci olarak ve glukoz-6- olarak hizmet edebilirdi. fosfataz - mikrozomal membran belirteci. Bununla birlikte, örneğin malat dehidrojenaz, P-glukuronidaz, NADP-H-sitokrom-c-redüktaz gibi bazı enzimlerin birden fazla fraksiyonda lokalize olduğu ortaya çıktı.Bu nedenle, her birinde subselüler fraksiyonların enzim belirteçlerinin seçimi özel duruma büyük bir dikkatle yaklaşılmalıdır.Ayrıca, bir işaretleyici enzimin yokluğu, karşılık gelen organellerin yokluğu anlamına gelmez.Bölünme sırasında enzimin organeller tarafından kaybolması veya inhibe edilmesi veya inaktive edilmesi muhtemeldir, bu nedenle en azından genellikle her fraksiyon için iki işaretleyici enzim belirlenir.
| kesir | Hacim, cm" | Genel üreme | Eksülasyon, 660 nm | Enzim aktivite birimleri | Kesirde aktivite verimi, % |
| 121 | 1:35 | 0,45 | 515 | ||
| 30 | 1:21,7 | 0,195 | 35,2 | 6,99 | |
| 21,5 | 1:105 | 0,3 | 186,3 | 37 | |
| 16,5 | 1:105 | 0,34 | 162 | 32,17 | |
| 21 | 1:27,7 | 0,41 | 51,5 | 10,23 | |
| 287 | 1:21,7 | 0,04 | 68,5 | 13,61 | |
| 503,5 | 100 |
2.7 Diferansiyel santrifüjleme ile fraksiyonlama
2.7.1 Sonuçların sunumu
Doku fraksiyonasyonundan elde edilen sonuçlar en uygun şekilde grafikler şeklinde sunulur. Bu nedenle, dokulardaki enzimlerin dağılımını incelerken, veriler en iyi histogramlar şeklinde sunulur ve bu da deneylerin sonuçlarını görsel olarak değerlendirmeyi mümkün kılar.
Numunedeki protein içeriğinin enzimatik aktivitesi, hem orijinal homojenatta hem de her izole edilmiş hücre altı fraksiyonunda ayrı ayrı belirlenir. Fraksiyonlardaki toplam enzimatik aktivite ve protein içeriği, orijinal homojenattaki karşılık gelen değerlerden önemli ölçüde farklı olmamalıdır.
Daha sonra, her fraksiyondaki enzimatik aktivite ve protein içeriği, bir histogramın yapıldığı esas alınarak toplam verimin %'si olarak hesaplanır. Her fraksiyondaki nispi protein miktarı, izolasyon sırasına göre apsis ekseni boyunca sırayla çizilir ve her fraksiyonun nispi spesifik aktivitesi, ordinat ekseni boyunca çizilir. Böylece, her fraksiyonun enzimatik aktivitesi, sütunların alanından belirlenir.
2.7.2 Analitik ultrasantrifüjleme
Amacı maddeleri ayırmak ve saflaştırmak olan hazırlayıcı santrifüjlemeden farklı olarak, analitik ultrasantrifüjleme esas olarak biyolojik makromoleküllerin ve diğer yapıların çökelme özelliklerini incelemek için kullanılır. Bu nedenle, analitik santrifüjlemede, özel tasarım rotorlar ve kayıt sistemleri kullanılır: malzemenin santrifüj alanındaki tortulasyonunu sürekli olarak izlemenizi sağlar.
Analitik ultrasantrifüjler, 70.000 rpm'ye kadar hızlara ulaşabilirken, 500.000 g'a kadar santrifüj ivmesi üretir. Rotorları, kural olarak, bir elips şeklindedir ve motora bir ip vasıtasıyla bağlanır, bu da rotorun dönüş hızını değiştirmeyi mümkün kılar. Rotor, bir soğutma cihazı ile donatılmış bir vakum odasında döner ve santrifüjde dönme eksenine paralel olarak kesinlikle dikey olarak yerleştirilmiş analitik ve dengeleme olmak üzere iki hücreye sahiptir. Dengeleme hücresi, analitik hücreyi dengelemeye hizmet eder ve hassas sistemli metal bir bloktur. Ayrıca, analitik hücrede karşılık gelen mesafelerin belirlendiği, dönüş ekseninden kesin olarak tanımlanmış bir mesafede bulunan iki indeks deliğine sahiptir. Kapasitesi genellikle 1 cm3 olan analitik hücre sektörel bir şekle sahiptir. Rotora düzgün bir şekilde takıldığında, dik olmasına rağmen, asma kovalı rotor ile aynı prensipte çalışır ve neredeyse ideal çökelme koşulları yaratır. Analitik hücrenin uçlarında kuvars camlı pencereler bulunmaktadır. Analitik ultrasantrifüjler, tüm santrifüjleme periyodu boyunca partiküllerin sedimantasyonunun izlenmesine izin veren optik sistemlerle donatılmıştır. Önceden belirlenmiş zaman aralıklarında çöken materyalin fotoğrafı çekilebilir. Proteinleri ve DNA'yı parçalara ayırırken, sedimantasyon, ultraviyole ve incelenen çözeltilerin farklı kırılma indekslerine sahip olduğu durumlarda, bir schlieren sistemi veya bir Rayleigh girişim sistemi kullanılarak absorpsiyon ile izlenir. Son iki yöntem, ışığın farklı yoğunluktaki bölgelerden oluşan şeffaf bir çözeltiden geçtiğinde, ışığın bölge sınırında kırılması gerçeğine dayanmaktadır. Sedimantasyon sırasında, kırılma merceği görevi gören ağır ve hafif parçacıkların bulunduğu bölgeler arasında bir sınır oluşur; bu durumda detektör olarak kullanılan fotoğraf plakasında bir tepe noktası belirir. Sedimantasyon sırasında, sınır hareket eder ve sonuç olarak, hızı malzemenin sedimantasyon oranını değerlendirmek için kullanılabilen tepe noktası hareket eder. İnterferometrik sistemler, schlieren sistemlerinden daha hassastır. Analitik hücreler, en sık kullanılan tek sektörlü ve çözücü ve çözünenin karşılaştırmalı çalışması için kullanılan iki sektörlüdür.
Biyolojide, makromoleküllerin moleküler ağırlıklarını belirlemek, elde edilen örneklerin saflığını kontrol etmek ve makromoleküllerdeki konformasyonel değişiklikleri incelemek için analitik ultrasantrifüj kullanılır.
2.8 Analitik ultrasantrifüj uygulaması
2.8.1 Molekül ağırlıklarının belirlenmesi
Analitik ultrasantrifüj kullanarak moleküler ağırlıkları belirlemek için üç ana yöntem vardır: sedimantasyon hızı belirleme, sedimantasyon dengesi yöntemi ve sedimantasyon dengesi yaklaşımı yöntemi.
Sedimantasyon hızı ile moleküler ağırlığın belirlenmesi en yaygın yöntemdir. Santrifüjleme yüksek hızlarda gerçekleştirilir, böylece başlangıçta hacim boyunca eşit olarak dağılmış olan parçacıklar, dönüş merkezinden yarıçap boyunca sırayla hareket etmeye başlar. Çözücünün zaten partikül içermeyen alanı ile bunları içeren kısmı arasında net bir arayüz oluşur. Bu sınır, santrifüjleme sırasında hareket eder; bu, yukarıdaki yöntemlerden birini kullanarak parçacıkların çökelme hızını belirlemeyi mümkün kılar ve bu hareketi bir fotoğraf plakasına kaydeder.
Sedimantasyon hızı aşağıdaki ilişki ile belirlenir:
x, dönme ekseninden cm cinsinden mesafedir,
t - s cinsinden zaman,
w, rad-s-1'deki açısal hızdır,
s, “molekülün” sedimantasyon katsayısıdır.
Sedimantasyon katsayısı, ivme birimi başına hızdır ve Seedberg birimlerinde ölçülür; 1 Swedberg birimi 10_13 s'ye eşittir. s'nin sayısal değeri, parçacıkların moleküler ağırlığına ve şekline bağlıdır ve belirli bir molekülün veya supramoleküler yapının bir değer özelliğidir. Örneğin, lizozimin sedimantasyon katsayısı 2.15 S'dir; katalaz, 11.35S'lik bir sedimantasyon katsayısına, 30 ila 50S arasında bakteriyel ribozom alt birimlerine ve 40 ila 60S arasında ökaryotik ribozom alt birimlerine sahiptir.
Burada M molekülün moleküler ağırlığı, R gaz sabiti, T mutlak sıcaklık, s molekülün çökelme katsayısı, D molekülün difüzyon katsayısı, v kısmi özgül hacimdir. bir gram çözünenin kapladığı hacim olarak kabul edildiğinde, p yoğunluk çözücüsüdür.
Sedimantasyon dengesi yöntemi. Bu yöntemle moleküler ağırlıkların belirlenmesi, 7.000-8.000 rpm-1 mertebesinde nispeten düşük rotor hızlarında gerçekleştirilir, böylece büyük moleküler ağırlığa sahip moleküller dibe çökmez. Ultrasantrifüj, bir yandan merkezkaç kuvvetlerinin etkisi altında kurulan parçacıklar dengeye ulaşana kadar, diğer yandan difüzyon kuvvetleri, yani parçacıkların hareketi durana kadar gerçekleştirilir. Daha sonra, elde edilen konsantrasyon gradyanına göre, maddenin moleküler ağırlığı "formülüne göre hesaplanır.
burada R gaz sabitidir, T mutlak sıcaklıktır, ω açısal hızdır, p çözücünün yoğunluğudur, v kısmi özgül hacimdir, cx ve c2 çözünen maddenin r ve r2 uzaklıklarındaki konsantrasyonudur. dönme ekseni.
Bu yöntemin dezavantajı, sedimantasyon dengesine ulaşmanın uzun zaman almasıdır - santrifüjün sürekli çalışmasıyla birkaç günden birkaç haftaya kadar.
Sedimantasyon dengesine yaklaşma yöntemi, "dengeyi kurmak için gereken büyük bir zaman yatırımıyla bağlantılı olarak önceki yöntemin dezavantajlarından kurtulmak için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, santrifüjlenmiş çözelti bir durumdayken moleküler ağırlıklar belirlenebilir. dengeye yaklaşma durumu İlk olarak, makromoleküller analitik hücrenin tüm hacmi boyunca eşit olarak dağıtılır, ardından santrifüjleme ilerledikçe moleküller yerleşir ve menisküs bölgesindeki çözeltinin yoğunluğu giderek azalır. dikkatlice kaydedilir ve daha sonra çok sayıda değişken içeren karmaşık hesaplamalarla belirli bir bileşiğin moleküler ağırlığı aşağıdaki formüllerle belirlenir:
burada R gaz sabitidir, T mutlak sıcaklıktır, v kısmi özgül hacimdir, p çözücünün yoğunluğudur, dcldr makromolekülün konsantrasyon gradyanı, hm ve gd menisküse ve tabanın tabanına olan mesafedir. sırasıyla test tüpü, cm ve sd, sırasıyla menisküsteki ve y tüpün altındaki makromoleküllerin konsantrasyonudur, Mm ve MR, maddenin konsantrasyonunun dağılımından belirlenen moleküler ağırlıkların değerleridir. sırasıyla menisküs ve tüpün alt kısmı.
2.8.2 Müstahzarların saflığının değerlendirilmesi
Analitik ultrasantrifüj, DNA, virüs ve protein preparatlarının saflığını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Molekülün moleküler ağırlığının doğru bir şekilde belirlenmesinin gerekli olduğu durumlarda, preparatların saflığı şüphesiz çok önemlidir. Çoğu durumda, müstahzarın homojenliği, çökelme hızının belirlenmesi yöntemi kullanılarak çökelme sınırının doğasına göre değerlendirilebilir: homojen bir müstahzar genellikle kesin olarak tanımlanmış bir sınır verir. Müstahzarda bulunan safsızlıklar, ek bir tepe veya omuz olarak görünür; ayrıca ana tepe noktasının asimetrisini de belirlerler.
2.8.3 Makromoleküllerdeki konformasyonel değişikliklerin incelenmesi
Analitik ultrasantrifüjlemenin bir başka uygulama alanı, makromoleküllerdeki konformasyonel değişikliklerin incelenmesidir. DNA molekülü örneğin tek veya çift sarmallı, doğrusal veya dairesel olabilir. Çeşitli bileşiklerin etkisi altında veya yüksek sıcaklıklarda DNA, örneğin sedimantasyon hızı değiştirilerek belirlenebilen bir dizi tersinir ve geri dönüşü olmayan konformasyonel değişikliklere uğrar. Molekül ne kadar kompakt olursa, çözeltideki sürtünme katsayısı o kadar düşük olur ve bunun tersi de geçerlidir: ne kadar az kompakt olursa, sürtünme katsayısı o kadar büyük olur ve sonuç olarak o kadar yavaş çöker. Böylece, örneğin üzerinde çeşitli etkilerden önce ve sonra sedimantasyon hızındaki farklılıklar, makromoleküllerde meydana gelen konformasyonel değişikliklerin tespit edilmesini mümkün kılar.
Örneğin aspartat transkarbamoilaz gibi allosterik proteinlerde, bir substrata ve küçük ligandlara bağlanmalarının bir sonucu olarak konformasyonel değişiklikler meydana gelir. Bir proteinin alt birimlere ayrılması, onun üre veya parakloromerküribenzoat gibi maddelerle işlenmesiyle indüklenebilir. Tüm bu değişiklikler, analitik ultrasantrifüj kullanılarak kolayca izlenebilir.
